Stabilire una co-coltura di interneuroni con cellule endoteliali periventricolari

Abstract

Fonte: Datta, D., et al. Saggi di migrazione, chemio-attrazione e co-coltura per cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergici. J. Vis. Exp. (2020)

Questo video dimostra una tecnica per stabilire una co-coltura di interneuroni con cellule endoteliali perivascolari. Le cellule vengono aggiunte a un inserto a un pozzetto posto all'interno di una piastra di coltura. Dopo che le cellule aderiscono al piatto, l'inserto viene rimosso, consentendo alle cellule di proliferare e interagire e formare una co-coltura.

Protocollo

1. Coltura e conservazione di cellule endoteliali periventricolari umane

1. Mantenere le cellule endoteliali periventricolari umane su piastre a 6 pozzetti rivestite di matrice di membrana basale (vedi Tabella dei materiali) in terreno di cellule endoteliali periventricolari (terreno E6 contenente 50 ng/mL di fattore di crescita dell'endotelio vascolare A [VEGF-A], 100 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti 2 [FGF2] e 5 μM di acido gamma-aminobutirrico [GABA]) a 37 °C e 5% di CO₂. Cambia mezzo a giorni alterni.
2. Scongelare la matrice della membrana basale a 4 °C e ottenere una soluzione 1:100 diluend....

Risultati

Figura 1: Preparazione dell'inserto di coltura. (A) Un inserto di coltura a due pozzetti. (B) Un inserto a un pozzetto fissato al centro di una piastra da 35 mm. (C) Il contorno della toppa rettangolare come osservato dopo aver rimosso l'inserto.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Soluzione di dissociazione accutasie	Millipore Sigma	SCR005	Soluzione di dissociazione cellulare (per cellule endoteliali periventricolari, fase 1.4)
Controllo delle cellule endoteliali umane	Dinamica cellulare	R1022
Integratore di Mezzo per il Controllo delle Cellule Endoteliali	Dinamica cellulare	Motore M1019
Fiale criogeniche	Fisher Scientifico	03-337-7Y
DMEMF/12 medio	Thermofisher Scientifico	11320033
Dmso	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medio	Thermofisher Scientifico	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientifico	PHG0261
Fibronectina	Thermofisher Scientifico	Codice 33016-015
Contenitore di congelamento	Thermofisher Scientifico	5100
GABA	Sigma-Aldrich	Codice: A2129
Emocitometro	Sigma-Aldrich	Z359629
Neuroni GABAergici umani	Dinamica cellulare	R1013
Terreno di base dei neuroni GABAergici umani	Dinamica cellulare	Motore M1010
Integratore neurale per neuroni GABAergici umani	Dinamica cellulare	Motore M1032
Laminina	sigma	L2020
Matrigel	Corning	Codice 356230	Matrice della membrana basale
Supporto di montaggio	Laboratori vettoriali	H-1200
poli-L-ornitina	sigma	p4957
Pbs	Thermofisher Scientifico	Codice: 14190
Tripan blu	Thermofisher Scientifico	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientifico	12563011	Soluzione di dissociazione cellulare (per interneuroni GABAergici e cellule endoteliali, sezioni 3 e 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Kit Completo	Tecnologie delle celle Lifeline	LL-0003	Componente del mezzo di controllo delle cellule endoteliali umane
Inserto di coltura in silicone a 2 pozzetti	ibidi	Codice 80209
Inserto di coltura in silicone a 3 pozzetti	ibidi	Codice 80369
Piatto da 35 mm	Corning	430165
Tubo conico da 15 ml	Fisher Scientifico	07-200-886
Soluzione di PFA al 4%	Fisher Scientifico	AAJ19943K2
piastra per coltura tissutale a 6 pozzetti	Fisher Scientifico	Codice 14-832-11