1. Coltura e conservazione di cellule endoteliali periventricolari umane
- Mantenere le cellule endoteliali periventricolari umane su piastre a 6 pozzetti rivestite di matrice di membrana basale (vedi Tabella dei materiali) in terreno di cellule endoteliali periventricolari (terreno E6 contenente 50 ng/mL di fattore di crescita dell'endotelio vascolare A [VEGF-A], 100 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti 2 [FGF2] e 5 μM di acido gamma-aminobutirrico [GABA]) a 37 °C e 5% di CO2. Cambia mezzo a giorni alterni.
- Scongelare la matrice della membrana basale a 4 °C e ottenere una soluzione 1:100 diluendola nel terreno freddo Eagle modificato/miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F12) di Dulbecco. Rivestire ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di soluzione di matrice. Incubare le piastre a 37 °C per almeno 1 ora prima dell'uso.
- Consentire alle cellule endoteliali periventricolari umane di raggiungere una confluenza dell'80%-90%. Aspirare il terreno dal pozzo. Lavare i pozzetti una volta con 1 mL di soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS) per pozzetto.
- Staccare le cellule aggiungendo 1 mL di soluzione di dissociazione cellulare (vedere la Tabella dei materiali) per pozzetto. Incubare a 37 °C per 5 min. Dopo 5 minuti, aggiungere 1 ml di terreno di coltura delle cellule endoteliali periventricolari. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
nota: Usiamo l'accutasio per la dissociazione cellulare qui, al contrario del TrypLE nelle sezioni 3 e 4.
- Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno cellulare endoteliale periventricolare.
- Contare le cellule vive utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano. Cellule di semina in piastre rivestite di matrice fresca ad una densità di 1,2 x 105 celle/cm2. Incubare a 37 °C e 5% CO2.
- Conservare le cellule endoteliali periventricolari umane mediante crioconservazione in mezzo di congelamento (90% di terreno di cellule endoteliali periventricolari e 10% di dimetilsolfossido [DMSO]).
- Dissociare e raccogliere le cellule seguendo i passaggi 1.3 e 1.4 sopra. Contare le cellule nella soluzione con il metodo di esclusione del blu di tripano.
- Centrifugare le celle a 500 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare a 5 x 106 cellule/mL di terreno di congelamento.
- Erogare 1 ml di terreno di congelamento più cellule per crioviale. Porre i flaconcini in una camera piena di isopropanolo e raffreddare per una notte a -80 °C a 1 °C/min. Trasferire le fiale in un serbatoio di azoto liquido il giorno successivo per la conservazione a lungo termine.
2. Preparazione di cellule endoteliali periventricolari umane per il test
- Consentire alle cellule endoteliali periventricolari umane di raggiungere la confluenza del 70%-80%.
- Dissociare le cellule seguendo i passaggi da 1.3 a 1.5 come descritto sopra. Contare le celle utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano.
3. Preparazione degli interneuroni GABAergici umani per il saggio
NOTA: Gli interneuroni GABAergici derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e il mezzo neuronale sono stati acquistati commercialmente (vedi Tabella dei Materiali). I neuroni sono generati differenziando una linea iPSC derivata da fibroblasti umani seguendo un protocollo sviluppato dal produttore. Le cellule sono state scongelate e coltivate secondo il protocollo del produttore.
- Scongelare gli interneuroni GABAergici umani e coltivarli in una piastra a 12 pozzetti per due settimane fino a una confluenza del 70%-80%.
- Il giorno del saggio, riscaldare la soluzione di dissociazione cellulare (vedere la tabella dei materiali) e un'aliquota di terreno neuronale a 37 °C per 10 minuti prima dell'uso.
- Aspirare il terreno da ciascun pozzetto contenente le cellule. Lavare le celle con 1 mL di 1x PBS sterile per pozzetto.
- Staccare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di dissociazione preriscaldata per pozzetto e incubare a 37 °C per 5 minuti. Aggiungere 1 mL di terreno neuronale per pozzetto. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta conica da 15 mL. Triturare delicatamente per dissociare i grumi cellulari.
- Centrifugare le cellule a 380 x g per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno neuronale. Contare le cellule vive utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano.
4. Preparazione delle cellule endoteliali umane di controllo per il test
NOTA: Le cellule endoteliali umane di controllo derivate da iPSC e il terreno delle cellule endoteliali sono stati acquistati commercialmente (Tabella dei materiali). Queste cellule endoteliali sono generate differenziando una linea iPSC derivata da fibroblasti umani al destino endoteliale seguendo un protocollo sviluppato dal produttore. Le cellule sono state scongelate e coltivate su substrato di Fibronectina secondo il protocollo del produttore. Le piastre rivestite di fibronectina sono state preparate seguendo il protocollo del produttore.
- Scongelare le cellule endoteliali umane e coltivarle in una piastra a 6 pozzetti con una confluenza dell'80%-90%.
- Il giorno del test, riscaldare la soluzione di dissociazione cellulare (vedere la tabella dei materiali) e un'aliquota di terreno endoteliale a 37 °C per 10 minuti prima dell'uso.
- Aspirare il terreno da ciascun pozzetto contenente le cellule. Lavare le celle con 1 mL di 1x PBS sterile per pozzetto.
- Staccare le cellule aggiungendo 0,5 mL di soluzione di dissociazione preriscaldata per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Aggiungere 1 mL di terreno cellulare endoteliale per pozzetto per neutralizzare la soluzione di dissociazione. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta conica da 15 mL.
- Centrifugare le celle a 200 x g per 5 min a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno cellulare endoteliale. Contare le cellule vive utilizzando il metodo di esclusione del blu di tripano.
5. Preparazione di inserti di coltura a un pozzetto
- Scongelare 1 mg/mL di soluzione di laminina a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C.
- Rivestire un numero appropriato di piastre da 35 mm con una soluzione di poli-L-ornitina allo 0,01% (1 ml per piastra). Incubare le piastre a temperatura ambiente per almeno 1 ora.
- Diluire 1 mg/mL di soluzione di laminina 1:300 in acqua sterile fino a una concentrazione finale di 3,3 μg/mL immediatamente prima dell'uso.
- Aspirare completamente la poli-L-ornitina da ogni piatto. Sciacquare accuratamente ogni piatto 3 volte con acqua sterile e aspirare completamente per evitare la tossicità cellulare indotta dalla poli-L-ornitina.
- Aggiungere 1 mL di soluzione di laminina da 3,3 μg/mL a ciascuna piastra e incubare a 37 °C per una notte o almeno 1 ora. Rimuovere la soluzione di laminina dalla capsula immediatamente prima dell'uso.
nota: In alternativa, conservare le piastre contenenti laminina a 4 °C. Equilibrare le piastre in un incubatore per colture cellulari a 37 °C prima dell'uso.
- Tagliare tre lati di un pozzetto di un inserto di coltura in silicone a due pozzetti (Figura 1A) utilizzando una lama sterile per generare un inserto a un pozzetto (Figura 1B).
nota: Tenere l'inserto a due pozzetti saldamente attaccato alla superficie della confezione originale durante il taglio per garantire un taglio regolare e proteggere l'adesività dell'inserto.
- Aspirare la soluzione di laminina dai piatti.
nota: Non lavare le stoviglie con PBS sterile o acqua dopo l'incubazione della laminina. Le superfici bagnate impediranno una stretta adesione dell'inserto di coltura.
- Rimuovere l'inserto a un pozzetto con una pinzetta sterile e posizionarlo al centro del piatto rivestito di poli-L-ornitina/laminina. Premere lungo i bordi dell'inserto per fissarlo alla superficie del piatto.
- Capovolgere con cautela il piatto per verificare che l'inserto aderisca saldamente.
- Tenere la piastra capovolta e segnare il confine dello scomparto dell'inserto utilizzando un pennarello nero indelebile con una punta ultrasottile (Figura 1C).
6. Saggio sulla migrazione co-culturale
- Co-sospendere 3 x 10,4 interneuroni GABAergici e 3 x 10,4 cellule endoteliali periventricolari umane in 70 μL di terreno di co-coltura (50% terreno di mantenimento periventricolare senza GABA e 50% terreno neuronale). Seminare questa soluzione cellulare all'interno del compartimento dell'inserto a un pozzetto. Preparare un numero appropriato di tali piastre di saggio.
nota: Il GABA non è stato aggiunto nel terreno di co-coltura per escludere l'effetto del GABA esogeno sulla migrazione.
- Controllare al microscopio per verificare che le cellule non perdano dallo scomparto dell'inserto.
- Aggiungere lentamente 1 mL di terreno di co-coltura lungo il lato del piatto per evitare che il rivestimento si asciughi.
nota: Aggiungere lentamente il terreno lungo il bordo del piatto in modo che l'inserto non venga disturbato.
- Come primo controllo, seminare 3 x 104 interneuroni GABAergici umani solo in 70 μL di terreno di co-coltura per inserto a un pozzetto. Prepara un numero adeguato di tali piatti.
- Come secondo controllo, co-seminare 3 x 104 interneuroni umani GABAergici con 3 x 104 cellule endoteliali umane di controllo in 70 μL di terreno di co-coltura per inserto a un pozzetto. Prepara un numero adeguato di piatti.
- Incubare le piastre per 24 ore a 37 °C e 5% di CO2. Dopo 24 ore di incubazione, controllare al microscopio per verificare che le cellule si siano attaccate correttamente e che non vi siano perdite.
- Dopo 48 ore di semina, rimuovere delicatamente l'inserto utilizzando una pinzetta sterile. Controllare al microscopio per verificare che lo strato cellulare non sia disturbato (giorno 0).
- Rimuovere il terreno e aggiungere 1 mL di terreno di cocoltura fresco.
nota: Metti da parte un numero adeguato di piatti per l'acquisizione delle immagini del giorno 0.
- Incubare le cellule per 5 giorni a 37 °C e 5% di CO2.
