Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Placcatura delle fette sugli inserti
- Riempire ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con 1.200 μl di terreno di coltura a fette. Riempire i pozzetti inutilizzati con 1.200 μl di PBS e riempire lo spazio centrale della piastra con 5 ml di 1x PBS. Conservare questa piastra a 37 °C.
- Utilizzando lo strumento della schiumarola, posizionare una fetta di cervello nel supporto sull'inserto, spingendo delicatamente la fetta da immergere completamente. Ripetere l'operazione per tutte le fette.
- Utilizzare un p1000 per estrarre 1 ml di terreno di coltura a fette dalla parte superiore dell'inserto ed erogarlo sul fondo del pozzetto. Rimuovere ed eliminare il terreno in eccesso fino a quando i bordi dell'agarosio attorno alla fetta di cervello diventano visibili. Fallo per le fette rimanenti.
- Raccogliere l'inserto per il bordo con una pinza, inclinarlo e rimuovere il fluido in eccesso. Quindi, trasferire rapidamente l'inserto in una piastra da 35 mm2 contenente 1 ml di terreno di coltura a fette. Usa 2 paia di pinze affilate per rimuovere l'agarosio attorno al tessuto, facendo attenzione a non allungare/danneggiare, tagliare o fare un buco nella membrana (più facile se fai uno strappo sul bordo dell'agarosio, quindi separa l'agarosio da entrambi i lati). Quindi, riposizionare l'inserto sulla piastra a 6 pozzetti e ripetere l'operazione per le fette rimanenti.
- In una cappa di coltura tissutale con il soffiatore spento (per evitare che le fette si secchino), rimuovere i frammenti di agarosio da ciascuna membrana.
- Trasferire le fette nella piastra a 6 pozzetti preparata al punto 1.1 e conservare la piastra a 37 °C. Incubare le fette per 24-48 ore.
2. Cambiare il Media della Cultura Slice
- Ripetere il passaggio 1.1 con una nuova piastra a 6 pozzetti.
- In una cappa per coltura tissutale con il soffiatore spento, trasferire gli inserti in nuove piastre a 6 pozzetti contenenti terreni di coltura freschi per fette.
3. Placcatura delle Cellule Tumorali sulla Fetta
- Sonicare il colorante Cm-DiI e centrifugare a velocità media per 2 minuti.
- Centrifugare le cellule tumorali utilizzate per la sovrapposizione a 201 x g per 5 minuti. Quindi risospendere in 2 ml di terreno di coltura a fette.
- Aggiungere 7 μl di Cm-DiI nei 2 ml di cellule e terreni e incubare a 37 °C per 20 minuti.
- Centrifugare le celle a 201 x g per 5 minuti e risospendere in 200 μl di terreno di affettatura. Triturare delicatamente per dissociare le celle (10-20 volte o fino a quando il pellet non è finito) e quindi aggiungere 800 μl di terreno di affettatura per ottenere un volume totale di 1.000 μl.
- Conta le cellule tumorali vitali usando il blu di tripano. Aggiungere microsfere fluorescenti verdi alle cellule tumorali alla stessa concentrazione delle cellule. Queste microsfere inerti serviranno da controllo. Centrifugare la miscela cellula/microsfera a 201 x g per 5 minuti e risospendere nella quantità desiderata di terreno di coltura a fette. Piastre di celle con una densità di 6.000 cellule/fetta in volume di 65 μl. Il numero di celle piastrate per fetta può essere aumentato a seconda delle preferenze e della disponibilità.
- Nella cappa di coltura tissutale, dosare le cellule in 65 μl di terreno/fetta al centro della fetta.
