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1. Preparazione dei MEA
Nota: i MEA sono composti da un substrato di vetro, elettrodi metallici microfabbricati e uno strato isolante in polimero SU-8. Ai fini di questo studio, i MEA disponibili in commercio sono stati ordinati con un layout di array di elettrodi personalizzato (Figura 1 A&B). I 68 elettrodi sono disposti in una griglia rettangolare divisa in due zone da una scanalatura larga 300 μm priva di elettrodi, cavi elettrici e isolamento. Ogni elettrodo ha una dimensione di 40 x 40 μm e sono distanziati di 200 μm da un centro all'altro. Quattro grandi elettrodi di terra sono posizionati intorno al sito di registrazione. Si differenziano dagli altri MEA standard disponibili in commercio per le loro dimensioni (21 mm x 21 mm) e non hanno una camera di registrazione fissa.
- Per la disinfezione, sciacquare i MEA con etanolo al 100% (2x), etanolo al 70% (1x) e acqua distillata (2x) per almeno 30 secondi ciascuno. Lasciate asciugare. Mettere 10 - 12 MEA in una capsula di Petri di vetro pulita (150 mm x 25 mm) e chiudere il coperchio.
- Autoclavare i MEA per 20 minuti a 120 °C. Conservare presso RT.
- Preparare la soluzione di rivestimento (vedere l'elenco dei materiali) per i MEA e conservare le aliquote a -20 °C.
- Mettere ogni MEA in una capsula di Petri sterile individuale (35 mm x 10 mm).
- Utilizzare una pipetta raffreddata per mettere 150 μl di soluzione di rivestimento refrigerata sopra gli elettrodi e chiudere il coperchio della capsula di Petri. Dopo circa 10 minuti, verificare la presenza di bolle d'aria sulla parte superiore degli elettrodi e, se necessario, rimuoverle delicatamente con una spatola rivestita di gomma. Lasciare riposare per 1 ora a temperatura ambiente (RT).
- Aspirare i residui della soluzione di rivestimento, lavare 1 volta con un terreno ottimizzato per neuroni prenatali ed embrionali e 2 volte con acqua distillata e sterile. Se i MEA non vengono utilizzati fino al giorno successivo, conservarli in acqua distillata sterile a 37 °C nell'incubatore per una notte (O/N). In caso contrario, lasciare asciugare direttamente a RT.
2. Ingredienti necessari per la preparazione e la crescita delle colture organotipiche
- Preparare una soluzione di lavaggio priva di calcio (vedere l'elenco dei materiali).
- Ricostituire il plasma di pollo in soluzione di lavaggio (1:1, agitare delicatamente, evitare la formazione di bolle), centrifugare a 3.000 x g per circa 20 minuti e travasare il contenuto limpido in una provetta sterile. Aliquotare 200 μl in provette criogeniche e conservare a -20 °C.
- Ricostituire la trombina dal plasma bovino di conseguenza (200 U/ml) e il filtro sterile (filtro dei pori da 0,2 μm). Aliquotare 200 μl in provette critogeniche e conservare a -20 °C.
- Per 30 colture, preparare 100 ml di terreno nutritivo (vedi elenco dei materiali).
3. Dissezione del tessuto del midollo spinale
Nota: La procedura produce, a seconda del numero di embrioni, fette di midollo spinale per circa 25 - 35 co-colture e viene preparata all'interno di una cappa a flusso laminare in condizioni sterili.
- Applicare una dose letale di pentobarbital (0,4 ml) sull'animale madre mediante iniezione intramuscolare. Confermare l'anestesia profonda controllando il riflesso di ritiro del pedale. Consegna embrionali embrionali di ratto del giorno 14 (E14) mediante taglio cesareo e sacrificio per decapitazione.
- Trasferire i corpi degli embrioni in una capsula di Petri riempita con soluzione di lavaggio sterile, refrigerata.
- Eseguire un taglio trasversale completo con un bisturi sopra gli arti posteriori e un altro sopra gli arti anteriori e rimuovere gli arti dal corpo. Quindi, fai un taglio sul piano frontale per separare i visceri dal pezzo posteriore contenente il midollo spinale.
- Per l'affettatura, trasferire i pezzi posteriori contenenti il midollo spinale uno alla volta su un disco di montaggio e tagliare a uno spessore di 225 - 250 μm con un tritatessuto. Mettere una goccia di soluzione di lavaggio sul fazzoletto tritato e trasferire le fette con una spatola in piastre di Petri da 35 mm x 10 mm riempite con soluzione di lavaggio sterile e refrigerata.
- Per ogni fetta separatamente, sezionare il midollo spinale lontano dal tessuto rimanente. Lasciare attaccati i gangli della radice dorsale.
- Lasciate riposare le fette per 1 ora a 4 °C.
4. Montaggio di fette di tessuto del midollo spinale su MEA
- Riscaldare il terreno nutritivo sterile nell'incubatore (37 °C, coperchio leggermente svitato per l'ossigenazione).
- Posizionare la MEA con una pinzetta sterile con punte rivestite di gomma su RT nella capsula di Petri sotto uno stereomicroscopio con l'array di elettrodi a fuoco. Centrare una gocciolina da 6 μl di plasma di pollo sull'array di elettrodi pulito, privo di polvere e sterile. Usando una piccola spatola, far scorrere con cautela due sezioni del midollo spinale con i lati ventrali rivolti l'uno verso l'altro nella gocciolina di plasma. Non toccare gli elettrodi con la spatola.
- Aggiungere 8 μl di trombina attorno alla gocciolina di plasma di pollo. Utilizzando la punta della pipetta per trombina, mescolare accuratamente e distribuire la miscela di plasma di pollo/trombina attorno alle due fette. Ancora una volta, non toccare direttamente l'array di elettrodi fragili. Poco prima della coagulazione, aspirare il plasma di pollo/trombina in eccesso.
- Tappare la capsula di Petri per mantenere un'elevata umidità mentre il gruppo MEA/coltura rimane per circa 1 ora in una camera umidificata all'interno dell'incubatore a 37 °C.
- Aggiungere con cautela 10 μl di terreno nutritivo nella camera di coltura, tappare la capsula di Petri e rimetterla nell'incubatore per circa 30 minuti.
- Posizionare ogni gruppo MEA/coltura con punte sterili rivestite di gomma in un tubo a rullo, aggiungere 3 ml di terreno nutritivo e chiudere ermeticamente il coperchio. Posizionare il tubo del rullo nel tamburo del rullo rotante a 1 - 2 giri/min nell'incubatore in un'atmosfera contenente CO2 al 5% a 37 °C.
- Cambiare metà del mezzo nutritivo dopo 7 giorni in vitro (DIV) e successivamente 1 - 2 volte a settimana.
5. Lesioni meccaniche
- Estrarre il gruppo MEA/coltura con punte sterili rivestite di gomma dal tubo del rullo e posizionarlo in una capsula di Petri senza mezzo nutritivo sotto uno stereomicroscopio con il tessuto a fuoco. Verificare visivamente che le due sezioni siano fuse.
- Tenere fermo il gruppo MEA/coltura posizionando una pinzetta con punte rivestite di gomma sul MEA.
- Posizionare una lama di bisturi nella scanalatura del MEA vicino alle fette di tessuto. Tieni il bisturi piuttosto orizzontalmente.
- Sollevare il manico del bisturi ma lasciare che la lama del bisturi rimanga nella scanalatura del MEA in modo tale che la lama "rotoli" dalla base alla punta e quindi tagli il tessuto che copre la scanalatura.
- Severe, se necessario, eventuali connessioni tissutali residue con una punta dell'ago da 25 G. Lavorare solo nell'area all'interno della scanalatura e non toccare i bordi teneri.
- Riposizionare il gruppo MEA/coltura nel tubo del rullo. Fornire 3 ml di terreno nutritivo fresco alle colture e rimetterle nel tamburo a rulli dell'incubatrice.
6. Registrazioni elettrofisiologiche dell'attività spontanea
- Per studiare la rigenerazione funzionale tra le due fette di midollo spinale dopo il numero scelto di DIV, montare l'assemblaggio MEA/coltura in una camera di registrazione al microscopio e applicare circa 500 μl di soluzione extracellulare (vedi elenco dei materiali).
- Attendere 10 minuti prima della prima registrazione per consentire al sistema di stabilizzarsi.
- Registrare l'attività spontanea di base 2 volte per circa 10 minuti da ciascun elettrodo di rilevamento dell'attività del MEA a RT.
- Per garantire condizioni extracellulari stabili, sostituire la soluzione extracellulare dopo ogni sessione di registrazione.
