1. Semina di iPSC umane nel bioreattore
- Incubare iPSC cresciute come monostrati in mTeSR1 integrati con 10 μM di inibitore ROCK Y-27632 (ROCKi). Aggiungere 1 mL di terreno integrato a ciascun pozzetto da una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti e incubare per 1 ora a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2,
nota: ROCKi è usato per proteggere le iPSC dissociate dall'apoptosi.
- Dopo 1 ora di incubazione, aspirare il terreno esaurito da ciascun pozzetto e lavare 1 volta con 1 mL di 1× PBS per pozzetto.
- Aggiungere 1 mL del terreno di distacco cellulare (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e incubare a 37 °C per 7 minuti fino a quando le cellule non si staccano facilmente dai pozzetti agitando delicatamente.
- Pipettare il terreno di distacco cellulare su e giù con una micropipetta P1000 fino a quando le cellule non si staccano e si dissociano in singole cellule. Aggiungere 2 mL di terreno di coltura cellulare completo a ciascun pozzetto per inattivare la digestione enzimatica e pipettare delicatamente le cellule in una provetta conica sterile.
- Centrifugare a 210 × g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in terreno di coltura (ad es. mTeSR1 integrato con 10 μM di ROCKi) e contare le iPSC con un emocitometro utilizzando il colorante blu di tripano.
- Seminare 15 × 106 singole cellule nel bioreattore (volume massimo di 100 mL) con 60 mL di mTeSR1 integrati con 10 μM di ROCKi a una densità cellulare finale di 250.000 cellule/mL.
- Inserire il recipiente contenente le iPSC nell'unità base universale collocata nell'incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2,
nota: L'agitazione del bioreattore viene mantenuta per 24 ore impostando il controllo dell'unità base universale a 27 giri/min per promuovere l'aggregazione di iPSC.
2. Differenziazione e maturazione di aggregati umani derivati da iPSC in organoidi cerebellari
- Definisci il giorno della semina di una singola cella come giorno 0.
- Il giorno 1, raccogliere 1 mL del campione aggregato iPSC utilizzando una pipetta sierologica. Mantenere il bioreattore in agitazione come prima posizionando l'unità di base universale con il bioreattore contenente gli aggregati in un flusso sterile prima di raccogliere il campione. Piastra la sospensione della cella in una piastra a 24 pozzetti con attacco ultrabasso. Verificare che si formino aggregati derivati da iPSC.
- Acquisizione di immagini con un microscopio ottico utilizzando un ingrandimento totale di 40x o 100x per misurare il diametro aggregato.
- Misura l'area degli aggregati in ogni immagine utilizzando il software FIJI.
- Seleziona "Analizza | Imposta misure" dalla barra dei menu e fare clic su "Area" e "OK".
- Seleziona "File | Apri" dalla barra dei menu per aprire un file immagine memorizzato. Seleziona lo strumento di selezione della linea presentato nella barra degli strumenti e crea una linea retta sopra la barra della scala presentata nell'immagine. Seleziona "Analizza | Imposta scala" dalla barra dei menu.
- In "Distanza nota", aggiungere l'estensione della barra di scala dell'immagine in μm. Definire l'"Unità di lunghezza" come μm. Fare clic su "Globale" per mantenere le impostazioni e su "OK". Seleziona Selezione ovale nella barra degli strumenti.
- Per ogni aggregato, delineare l'area con lo strumento ovale. Seleziona "Analizza | Misura". Calcolare il loro diametro in base all'area misurata, considerando che gli aggregati sono approssimativamente sferici utilizzando
con A come area dell'aggregato.
- Quando il diametro medio degli aggregati è di 100 μm, sostituire l'80% del terreno esaurito con mTeSR1 fresco senza ROCKi. Quando gli aggregati raggiungono i 200-250 μm di diametro, sostituire tutto il terreno esaurito con gfCDM (Tabella 1), lasciando che gli organoidi si depositino sul fondo del bioreattore.
nota: Se il diametro medio dell'aggregato supera i 350 μm, non avviare il protocollo di differenziazione. Ripetere la semina di singole cellule. Generalmente, ci vuole circa 1 giorno perché l'aggregato raggiunga un diametro medio di 100 μm.
- Inserire il bioreattore contenente gli aggregati nell'unità base universale posta nell'incubatore a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO2.
- Ridurre l'agitazione del bioreattore a 25 giri/min.
- Il giorno 2, ripetere i passaggi 2.2, 2.3 e 2.4 per valutare il diametro dell'aggregato. Aggiungere 30 μL di FGF2 (concentrazione finale, 50 ng/mL) e 60 μL di SB431542 (concentrazione finale, 10 μM) a 60 mL di terreno di differenziazione gfCDM (Tabella 1). Sostituire tutto il terreno esaurito dal bioreattore con il gfCDM integrato. Ripetere il passaggio 2.6.
NOTA: SB431542 è fondamentale per inibire la differenziazione mesendodermica, inducendo la differenziazione neurale. L'FGF2 viene utilizzato per promuovere la caudalizzazione del tessuto neuroepiteliale.
- Il giorno 5, ripetere i passaggi 2.2, 2.3, 2.4 e 2.8.
nota: La dimensione dell'aggregato dovrebbe aumentare durante il protocollo di differenziazione. Tuttavia, il diametro è critico solo quando inizia la differenziazione perché questo parametro potrebbe influenzare l'efficacia della differenziazione.
- Il giorno 7, ripeti i passaggi 2.2, 2.3 e 2.4. Diluire FGF2 e SB431542 a 2/3: aggiungere 20 μL di FGF2 e 40 μL di SB431542 a 60 mL di terreno di differenziazione gfCDM. Sostituire tutto il terreno esaurito dal bioreattore con gfCDM integrato. Ripetere il passaggio 2.6 e aumentare l'agitazione del bioreattore a 30 giri/min.
- Il giorno 14, ripetere i passaggi 2.2, 2.3 e 2.4. Aggiungere 60 μL di FGF19 (concentrazione finale, 100 ng/mL) a 60 mL di terreno di differenziazione gfCDM. Sostituire tutto il terreno esaurito del bioreattore con gfCDM integrato con FGF19. Ripetere il passaggio 2.6.
nota: FGF19 viene utilizzato per promuovere la polarizzazione delle strutture del mesencefalo.
- Il giorno 18, ripeti i passaggi 2.2, 2.3, 2.4 e 2.11.
- Il giorno 21, ripeti i passaggi 2.2, 2.3 e 2.4. Sostituire tutto il terreno esaurito dal bioreattore con un terreno neurobasale completo (Tabella 1). Ripetere il passaggio 2.6.
nota: Il terreno neurobasale è un mezzo basale utilizzato per mantenere la popolazione di cellule neuronali all'interno dell'organoide.
- Il giorno 28, ripeti i passaggi 2.2, 2.3 e 2.4. Aggiungere 180 μL di SDF1 (concentrazione finale, 300 ng/mL) a 60 mL di terreno neurobasale completo. Sostituire tutto il terreno esaurito dal bioreattore con un terreno neurobasale completo integrato con SDF1. Ripetere il passaggio 2.6.
nota: SDF1 viene utilizzato per facilitare l'organizzazione di strati cellulari distinti.
- Il giorno 35, ripetere i passaggi 2.2, 2.3 e 2.4. Sostituire tutto il terreno esaurito dal bioreattore con un terreno BrainPhys completo (Tabella 1). Ripetere il passaggio 2.6.
nota: BrainPhys è un mezzo neuronale che supporta i neuroni sinapticamente attivi.
- Sostituire 1/3 del volume totale ogni 3 giorni con il terreno BrainPhys completo fino al 90° giorno di differenziazione.
Tabella 1: Soluzioni stock e preparazione dei terreni. Sono elencati tutti i componenti e i volumi utilizzati per preparare i terreni per il protocollo di mantenimento e differenziazione delle iPSC, nonché le soluzioni stock di fattori di crescita e piccole molecole. Per le soluzioni stock, sono elencate tutte le concentrazioni stock e i protocolli per la ricostituzione.
| Preparazione dei media | mTeSR1
Volume finale: 500 mL | 1. Scongelare mTeSR1 5× integratore a temperatura ambiente (RT) o a 4 °C durante la notte e mescolare con il terreno basale
2. Conservare il terreno mTeSR1 completo a 4 °C per un massimo di 2 settimane o preparare aliquote da 40 mL e conservare a -20 °C
3. Preriscaldare mTeSR1 completo a RT prima dell'uso |
gfCDM (terreno chimicamente definito privo di fattore di crescita)
Volume finale: 60 mL | 30 mL di Ham's F12 30 mL IMDM 600 μL concentrato lipidico chimicamente definito (1 % v/v) 2,4 μL monotioglicerolo (450 μM) 30 μL di apo-transferrina (soluzione madre a 30 mg/mL in acqua, concentrazione finale: 15 μg/mL) 300 mg di BSA purificato per cristallizzazione (5 mg/mL) 42 μL di insulina (concentrazione madre a 10 mg/mL, concentrazione finale: 7 μg/mL) 300 μL P/S (0,5% v/v, 50 U/ml penicillina/50 μg/ml di streptomicina) |
Neurobasale
Volume finale: 60 mL | 60 mL di Neurobasal medium, 600 μL di N2, integratore 600 μL, Glutamax I, 300 μL P/S (0,5 % v/v). |
Completa BrainPhys
Volume finale: 60 mL | 60 ml di BrainPhys 1,2 ml di integratore neuronale NeuroCult SM1 600 μl di integratore N2 12 μl di BDNF (concentrazione finale: 20 ng/mL) 12 μl di GDNF (concentrazione finale: 20 ng/mL) 300 μl di dibutirril-cAMP (concentrazione standard: 100 mg/mL in acqua, concentrazione finale: 1 mM) 42 μL di acido ascorbico (concentrazione standard: 50 μg/mL in acqua, concentrazione finale: 200 nM) |
| Soluzioni stock di fattori di crescita e piccole molecole | Fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF/FGF2)
Concentrazione di riserva: 100 μg/mL | 1. Ricostituire in 5 mM di Tris, pH 7,6, alla concentrazione di 10 mg/mL
2. Diluire con lo 0,1 % di BSA in PBS (v/v) fino a una concentrazione finale di 100 μg/mL |
Fattore 1 derivato dalle cellule stromali (SDF1)
Concentrazione di riserva: 100 μg/mL | 1. Ricostituire in acqua ad una concentrazione di 10 mg/mL
2. Diluire con lo 0,1 % di BSA (v/v) in PBS fino a una concentrazione finale di 100 μg/mL. |
Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF)
Concentrazione di base: 100 μg/mL< |
Fattore neurotrofico derivato da cellule gliali (GDNF)
Concentrazione di riserva: 100 μg/mL |
Fattore di crescita dei fibroblasti 19 (FGF19)
Concentrazione di riserva: 100 μg/mL | 1. Ricostituire in 5 mM di fosfato di sodio, pH 7,4, alla concentrazione di 10 mg/mL
2. Diluire con lo 0,1 % di BSA in PBS (v/v) fino a una concentrazione finale di 100 μg/mL |
Inibitore ROCK Y-27632
Concentrazione di magazzino: 10mM | Ricostituire in DMSO a una concentrazione di 10 mM. |
SB431542
Concentrazione di magazzino: 10mM |
Insulina
Concentrazione di riserva: 10 mg/mL | 1. Ricostituire 10 mg di insulina in 300 μL di 10 mM di NaOH
2. Aggiungere con cautela 1 M di NaOH fino a quando la soluzione diventa trasparente
3.Riempire fino a 1 ml con acqua sterile |
Tabella 2: Soluzioni per la preparazione di organoidi per criosezione e immunocolorazione. Sono elencati tutti i componenti e i volumi utilizzati per preparare le soluzioni utilizzate nella preparazione di organoidi per criosezione e immunocolorazione.
| Gelatina/Saccarosio<br />
Concentrazione finale: 7,5%/15% p/p | 1. Pesare 15 g di saccarosio e 7,5 g di gelatina in una bottiglia di vetro Schott sterile e mescolare bene
2. Preriscaldare il PBS 1× a 65 °C
3. Aggiungere PBS 1× preriscaldato fino a un peso finale di 100 g e mescolare bene
4. Mettere la bottiglia di vetro Schott in una piastra riscaldante a 65 °C e agitare fino a quando la gelatina non si scioglie
5. Incubare a 37 °C fino a quando la soluzione non si stabilizza |
