Generazione di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti indotte utilizzando bioreattori monouso

Abstract

Fonte: Silva, T.P., et al. Generazione scalabile di organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti umane e caratterizzazione mediante immunocolorazione. (2020)

Questo video mostra una tecnica per generare organoidi cerebellari maturi da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) utilizzando un bioreattore 3D monouso. Il bioreattore facilita la formazione di aggregati iPSC, che vengono poi sottoposti a trattamento con una serie di terreni di coltura arricchiti in fattori di crescita e chemochine che inducono la differenziazione degli aggregati iPSC in organoidi cerebellari maturi. Successivamente, gli organoidi vengono raccolti e crioconservati per ulteriori analisi.

Protocollo

1. Semina di iPSC umane nel bioreattore

1. Incubare iPSC cresciute come monostrati in mTeSR1 integrati con 10 μM di inibitore ROCK Y-27632 (ROCKi). Aggiungere 1 mL di terreno integrato a ciascun pozzetto da una piastra di coltura tissutale a 6 pozzetti e incubare per 1 ora a 37 °C, 95% di umidità e 5% di CO₂,
   nota: ROCKi è usato per proteggere le iPSC dissociate dall'apoptosi.
2. Dopo 1 ora di incubazione, aspirare il terreno esaurito da ciascun pozzetto e lavare 1 volta con 1 mL di 1× PBS per pozzetto.
3. Aggiungere 1 mL del terreno di distacco cellulare (vedere la Tabella dei materiali<....

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Kit BrainPhys Neuronal Medium N2-A e SM1	5793 - 500mL	Tecnologie per le cellule staminali
Concentrato lipidico di costituzione chimica definita	11905031	ThermoFisher
BSA purificato per cristallizzazione	Codice: 5470	sigma
DMEM-F12	Codice 32500-035	ThermoFisher
Siero fetale bovino	A3840001	ThermoFisher
Gelatina proveniente dalla pelle bovina	G9391	sigma
Glutamax I	Codice 10566-016	ThermoFisher
Dibutirrile cAMP	SC- 201567B -500mg	Frilabo
F12 di Ham	21765029	ThermoFisher
Linea iPSC Episomiale Umana	Codice: A18945	ThermoFisher	iPSC6.2
IMDM	12440046	ThermoFisher
insulina	91077C	sigma
iPS DF6-9-9T.B		WiCell
Iso-pentano	PHR1661-2ML	sigma
Acido L-ascorbico	A-92902	sigma
Matrigel	Codice 354230	Corning	matrice a membrana basale
Monotioglicerolo	Codice: M6154	sigma
mTeSR1	85850 -500ml	Tecnologie delle cellule staminali
Integratore N2	17502048	ThermoFisher
Neurobasale	12348017	ThermoFisher
Paraformaldeide	158127	sigma
PBS-0.1 Recipiente monouso	Numero dell'articolo: IA-0.1-D-001	PBS Biotecnologie
Unità base MagDrive PBS-MINI	CODICE: IA-UNI-B-501	PBS Biotecnologie
BDNF umano ricombinante	450-02	Peprotech
BFGF/FGF2 umano ricombinante	100-18B	Peprotech
FGF19 umano ricombinante	100-32	Peprotech
GDNF umano ricombinante	450-10	Peprotech
SDF1 umano ricombinante	300-28A	Peprotech
Inibitore di ROCK	Y-27632 72302	Tecnologie delle cellule staminali
SB431542	S4317	sigma
saccarosio	S7903	sigma
Composto Tissue-Tek O.C.T.	Codice 25608-930	VWR