Isolamento delle cellule immunitarie infiltranti il tumore da un cervello murino

Abstract

Fonte: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Isolamento e analisi citometrica a flusso di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il glioma. J. Vis. Exp. (2015)

Il video dimostra l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il tumore dal cervello di un topo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica. Segue la centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere le cellule immunitarie per ulteriori analisi.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

Prepara la soluzione di miscela di terreni di centrifugazione a densità inserendo 90 ml di 10x PBS in 264 ml di acqua deionizzata ultrapura (3.93x) in un contenitore di plastica sterile. Titolare a pH 7,0-7,2 con HCl e sterilizzare il filtro attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare a 4 °C.

Preparare il terreno di centrifugazione con densità al 70% combinando 18 ml di soluzione di miscelazione per terreni di centrifugazione a densità con 30 ml di terreno di centrifugazione a densità (vedere l'elenco dei materiali per i dettagli) in una provetta da centrifuga in polipropilene da 50 ml. Conservare a 4 °C, ma portare a RT prima dell'uso.

Prepara il terreno di centrifugazione con densità del 37% combinando 9,6 ml di DPBS con 10,4 ml di terreno di centrifugazione con densità al 70% in una provetta da centrifuga da 50 ml. Conservare a 4 °C, ma portare a RT prima dell'uso.

1. Isolamento delle PBMC infiltranti il glioma

1. Usando una lama di rasoio pulita e a taglio singolo, isolare l'area del cervello contenente il tumore praticando un taglio sagittale al centro del cervello per dividere in due i due emisferi. Capovolgere il lato mediale dell'emisfero omolaterale verso il basso ed eseguire due tagli coronali a livello del cervelletto e del bulbo olfattivo per isolare il tessuto bersaglio contenente l'impianto tumorale (Figura 1A). Una porzione equivalente dell'emisfero controlaterale può anche essere isolata e utilizzata come controllo negativo.
2. Posizionare il tessuto bersaglio nel macinatore di carta Dounce in vetro contenente 1 ml di DPBS, spingere lo stantuffo fino in fondo e ruotare 7 volte per interrompere inizialmente il tessuto. Sollevare lo stantuffo per consentire al liquido di depositarsi sul fondo del macina fazzoletti. Ripeti questo passaggio tre volte; Tuttavia, ruotare lo stantuffo solo 4 volte durante le due ripetizioni successive e 3 volte durante l'ultima ripetizione per evitare di triturare eccessivamente il tessuto.
3. Utilizzando una micropipetta P-1000, applicare in sequenza tre volumi da 1 ml di DPBS ghiacciato lungo i lati dello stantuffo da risciacquare nel macinatore di fazzoletti.
4. Risospendere la materia cerebrale triturata pipettandola su e giù e mettendola in una provetta da centrifuga da 15 ml etichettata su ghiaccio. Sciacquare i lati del macina fazzoletti Dounce con 1 ml aggiuntivo di DPBS ghiacciato e aggiungere alla stessa provetta da centrifuga da 15 ml. Conservare tutte le provette contenenti materia cerebrale triturata su ghiaccio fino a quando tutti i campioni non sono stati elaborati.
5. Una volta che tutti i campioni sono stati processati, centrifugare la materia cerebrale triturata nelle provette da centrifuga da 15 ml a 740 x g (RCF max) per 20 minuti a 4 °C.
6. Rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica da 10 ml e una pistola per pipette e risospendere la materia cerebrale pellettata in 1 ml di enzimi digestivi collagenasi/DNasi-I precedentemente preparati utilizzando un P-1000. Mettere le provette da centrifuga da 15 ml in un rack per provette e metterle a bagnomaria a 37 °C per 15 minuti.
7. Agitare delicatamente i campioni due volte durante il periodo di incubazione muovendo le provette per facilitare la disaggregazione dei tessuti.
8. Aggiungere 6 ml di DPBS ghiacciato utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml a ciascuna provetta per diluire gli enzimi digestivi. Pipettare su e giù per risospendere e filtrare i volumi totali attraverso filtri sterili a rete di nylon da 70 μm in nuove provette da centrifuga da 15 ml etichettate su ghiaccio.
9. Far girare la sospensione di cellule cerebrali verso il basso a 740 x g (RCF max) per 20 minuti a 4 °C per ottenere un pellet a cellula singola (Figura 1B). Dopo aver tolto le provette da 15 ml dalla centrifuga, metterle sul ghiaccio e aumentare la temperatura impostata sulla centrifuga a circa 21 °C in preparazione per il passaggio successivo.
10. Rimuovere completamente il surnatante da ciascuna provetta contenente le cellule cerebrali e risospendere inizialmente i pellet in 1 ml di terreno di centrifugazione con densità al 70% utilizzando una micropipetta P-1000. Quindi aggiungere altri 4 millilitri di terreno di centrifugazione con densità al 70% in ciascuna provetta utilizzando una pipetta sierologica da 10 ml. Avvitare saldamente i tappi e omogeneizzare la sospensione cellulare capovolgendola delicatamente in tubi più volte.
11. Rimuovere dal ghiaccio le provette da centrifuga da 15 ml contenenti cellule cerebrali risospese in un mezzo di centrifugazione con densità al 70% e metterle in un rack per provette a RT. Uno alla volta, sovrapporre con cura 2 ml di soluzione di terreno di centrifugazione con densità al 37% sui 5 ml di terreno di centrifugazione con densità al 70% con una micropipetta P-1000 per formare un'interfaccia pulita tra i due strati di terreno di centrifugazione a densità (Figura 1C).
    1. Utilizzare un pennarello a punta fine per indicare la posizione dell'interfaccia in modo che possa essere facilmente identificata dopo la centrifugazione, quando la distinzione diventa meno evidente.
12. Centrifugare le provette da centrifuga da 15 ml a 740 x g (RCF max) per 20 minuti a RT senza interruzioni per evitare di interrompere l'interfaccia.
13. Dopo la centrifugazione, raccogliere le PBMC che si sono accumulate all'interfaccia tra i due strati di terreno di centrifugazione a densità (Figura 1D) introducendo una micropipetta P-200 nella provetta lungo il suo lato, bypassando accuratamente lo strato lipidico.
    1. Una volta raggiunto il livello della banda PBMC, estrarre lentamente 200 μl dalla superficie dello strato di terreno di centrifugazione con densità del 70% e posizionarlo in una provetta FACS in polipropilene rispettivamente etichettata su ghiaccio. Ripetere una volta per un volume totale di 400 μl per campione.
14. Aggiungere 3 ml di tampone di flusso a ciascuna provetta FACS contenente 400 μl di PBMC per diluire sufficientemente il mezzo di centrifugazione a densità, quindi centrifugare le cellule a 660 x g (RCF max) per 20 minuti a 4 °C.

Risultati

Figura 1: Isolamento di PBMC infiltranti il glioma. (A) Strategia per la dissezione del tessuto cerebrale di topo contenente impianti di glioma ortotopico in stadio iniziale. Il pannello superiore mostra la bisezione sagittale dell'emisfero omolaterale lontano dall'emisfero controlaterale. Il pannello inferiore mostra i due tagli coronali aggiuntivi necessari per isolare il tessuto b...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Modifica di Dulbecco delle aquile medie	Gibco	Codice 12430-054	Con 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina, 25 mM di HEPES e rosso fenolo
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Gibco	Codice 14190-144	Senza cloruro di calcio o cloruro di magnesio
Siero fetale bovino	Omega Scientific Inc.	FB-11
Penicillina Streptomicina	Gibco	Codice: 15140-122	10.000U/ml Penicillina; 10.000μg/ml Streptomicina
Microprovette coniche in polipropilene da 0,6 ml	Genesee Scientifico	22-272
Secchiello per ghiaccio in poliuretano	Fisherbrand	02-591-45	Capacità: 0,152 once (4,5 litri)
Collagenasi (Tipo I-S)	Sigma Aldrich	C1639	Da Clostridium histolyticum
Desossiribonucleasi I	Worthington Biochemical Corp.	LS002007	>2.000 unità Kunitz per mg di peso secco
Forbici da dissezione grandi	Ted Pella Inc.	Anno 1316
Piccole forbici da dissezione	FST	Codice 14094-11
Pinza terminale smussata	Ted Pella Inc.	Codice 13250
Grinder per tessuti Dounce in vetro da 7 ml	Kontes	KT885300-0007
Mezzi di centrifugazione a densità Percoll	GE Sanità	GE17-0891-01
Pipette sierologiche da 10 mL	Genesee Scientifico	12-104	Monouso; sterile
Filtri cellulari sterili in rete di nylon da 70 μm	Fisherbrand	22363548
Provette da centrifuga in polipropilene da 15 ml	Genesee Scientifico	21-103	Fondo conico
Provette da centrifuga in polipropilene da 50 ml	Genesee Scientifico	21-108	Fondo conico
Tubi FACS in polipropilene a fondo tondo 12x75mm	Fisherbrand	14-956-1B