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Articolo metodologico
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8 luglio 2025
Fonte: Baker, G. J., et al., Lowenstein, P. R. Isolamento e analisi citometrica a flusso di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il glioma. J. Vis. Exp. (2015)
Il video dimostra l'isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico infiltranti il tumore dal cervello di un topo utilizzando la dissociazione meccanica e la digestione enzimatica. Segue la centrifugazione in gradiente di densità per raccogliere le cellule immunitarie per ulteriori analisi.
Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
Prepara la soluzione di miscela di terreni di centrifugazione a densità inserendo 90 ml di 10x PBS in 264 ml di acqua deionizzata ultrapura (3.93x) in un contenitore di plastica sterile. Titolare a pH 7,0-7,2 con HCl e sterilizzare il filtro attraverso un filtro da 0,22 μm. Conservare a 4 °C.
Preparare il terreno di centrifugazione con densità al 70% combinando 18 ml di soluzione di miscelazione per terreni di centrifugazione a densità con 30 ml di terreno di centrifugazione a densità ....
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Figura 1: Isolamento di PBMC infiltranti il glioma. (A) Strategia per la dissezione del tessuto cerebrale di topo contenente impianti di glioma ortotopico in stadio iniziale. Il pannello superiore mostra la bisezione sagittale dell'emisfero omolaterale lontano dall'emisfero controlaterale. Il pannello inferiore mostra i due tagli coronali aggiuntivi necessari per isolare il tessuto b.......
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Modifica di Dulbecco delle aquile medie | Gibco | Codice 12430-054 | Con 4,5 g/L di D-glucosio, L-glutammina, 25 mM di HEPES e rosso fenolo |
| Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco | Gibco | Codice 14190-144 | Senza cloruro di calcio o cloruro di magnesio |
| Siero fetale bovino | Omega Scientific Inc. | FB-11 | |
| Penicillina Streptomicina | Gibco | Codice: 15140-122 | 10.000U/ml Penicillina; 10.000μg/ml Streptomicina |
| Microprovette coniche in polipropilene da 0,6 ml | Genesee Scientifico | 22-272 | |
| Secchiello per ghiaccio in poliuretano | Fisherbrand | 02-591-45 | Capacità: 0,152 once (4,5 litri) |
| Collagenasi (Tipo I-S) | Sigma Aldrich | C1639 | Da Clostridium histolyticum |
| Desossiribonucleasi I | Worthington Biochemical Corp. | LS002007 | >2.000 unità Kunitz per mg di peso secco |
| Forbici da dissezione grandi | Ted Pella Inc. | Anno 1316 | |
| Piccole forbici da dissezione | FST | Codice 14094-11 | |
| Pinza terminale smussata | Ted Pella Inc. | Codice 13250 | |
| Grinder per tessuti Dounce in vetro da 7 ml | Kontes | KT885300-0007 | |
| Mezzi di centrifugazione a densità Percoll | GE Sanità | GE17-0891-01 | |
| Pipette sierologiche da 10 mL | Genesee Scientifico | 12-104 | Monouso; sterile |
| Filtri cellulari sterili in rete di nylon da 70 μm | Fisherbrand | 22363548 | |
| Provette da centrifuga in polipropilene da 15 ml | Genesee Scientifico | 21-103 | Fondo conico |
| Provette da centrifuga in polipropilene da 50 ml | Genesee Scientifico | 21-108 | Fondo conico |
| Tubi FACS in polipropilene a fondo tondo 12x75mm | Fisherbrand | 14-956-1B |
