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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione di Strumenti, Terreni Culturali e Piatti
- Preparare due forbici da dissezione da laboratorio in acciaio inossidabile e due pinze da laboratorio in acciaio inossidabile. Autoclavare tutti gli strumenti in autoclave e metterli in una cappa di coltura O/N sotto luce ultravioletta (UV) per la sterilizzazione.
- Preparare 500 ml di terreno di coltura MEM (10% siero fetale bovino [FBS], 20 mM KCl, 25 mM NaHCO3, 30 mM D-glucosio, 2 mM L-glutammina, 100 U/ml di penicillina, 100 μg/ml di streptomicina e 6 μg/ml di ampicillina) e sterilizzare con il filtro. Conservare a 4 °C per mesi.
- Preparare piastre di coltura a 24 pozzetti contenenti vetrini coprioggetto da 14 mm, spessore numero 1. Autoclavare i vetrini coprioggetti e rivestirli con 100 mg/L di poli-d-lisina (PDL). La luce UV sterilizza O/N.
2. Preparazione di soluzioni di coltura di cellule di granuli cerebellari (CGC)
- Preparare la 'soluzione A' (100 ml) in autoclave, trattata con luce UV, dH2O sterile contenente 250 mg di glucosio, 300 mg di albumina sierica bovina [BSA], 955 mg di soluzione salina tamponata con fosfato [PBS] (priva di Ca2+ e Mg+) e 1 ml di MgSO4.8% 4.7H2O.
- Preparare la 'soluzione B' (10 ml) contenente 1 ml di tripsina 5 mg/ml diluita in 9 ml di soluzione A.
- Preparare la 'soluzione C' (10 ml) contenente 1.000 unità di DNasi, 0,5 mg di inibitore della tripsina di soia, 100 μl di MgSO4.8% 4.7H2O, diluita a 10 ml con la soluzione A.
- Preparare la 'soluzione D' (20 ml) contenente 3,2 ml di soluzione C, diluita a 20 ml con la soluzione A.
- Preparare la soluzione salina bilanciata (EBSS) di BSA/Earle contenente EBSS, 25 mM di NaHCO3, 3 mM di MgSO 4,7H2O e 4% di BSA, pH 7,4.
- Preparare l'estere metilico di L-leucina (LME) aggiungendo LME puro in 5 ml di terreno di coltura MEM per ottenere una concentrazione finale di 150 mM LME, riportare la soluzione a pH 7,4 utilizzando un pHmetro da banco e sterilizzare con filtro utilizzando un filtro per siringa da 28 mm di polietere sulfone (PES) da 0,2 μm.
3. Coltivare i CGC
- Raccogli il cervelletto da cuccioli di ratto di 4-7 giorni. Porre immediatamente in una capsula di Petri contenente 5 ml di soluzione A con ghiaccio.
- Versare la soluzione in eccesso dal cervelletto e posizionare il fazzoletto nel coperchio della capsula di Petri.
- Tritare finemente il fazzoletto con una lama di rasoio ben fiammata in almeno tre direzioni diverse.
- Aggiungere il tessuto tritato alla soluzione B (sciacquare la capsula di Petri con una soluzione per assicurarsi che si perda una quantità limitata di tessuto) e immergerlo nel bagnomaria a 37 °C per 5 minuti. Agitare delicatamente ogni due minuti.
- Aggiungere la soluzione D (20 ml) nella provetta per neutralizzare la tripsina, agitare e centrifugare a 65 x g per 5 minuti.
- Versare il surnatante.
- Risospendere in 4 ml di soluzione C. Triturare bene (circa 10 volte ciascuna) con tre pipette di vetro fiammato di diametro decrescente, fino a quando la sospensione è il più omogenea possibile.
- Aggiungere lentamente e delicatamente alcune gocce di questo omogeneizzato sopra il BSA/EBSS. Se inizia a penetrare attraverso il BSA/EBSS, triturare di più e/o aggiungere un po' più di soluzione C. L'omogeneizzato dovrebbe essere posizionato in uno strato sopra il BSA/EBSS. Non agitare. Centrifugare a 100 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet (morbido) in 1 ml di terreno MEM.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e una piastra a 800.000 cellule/vetrino coprioggetti in 500 μl di terreno MEM. Porre in un'incubatrice a 37 °C con 6% di CO2.
- Cambiare il mezzo il giorno successivo (24-36 ore dopo la preparazione). Preparare una soluzione di terreno MEM contenente 10 μM dell'inibitore del ciclo cellulare arabinofuranosil citidina (AraC).
- Per ogni vetrino coprioggetti, conservare 250 μl del vecchio terreno in una piastra fresca a 24 pozzetti, aspirare il resto, aggiungere 250 μl di terreno MEM normale e aspirarlo per lavare le cellule. Quindi, aggiungere i 250 μl di terreno vecchio alle cellule e rabboccare con 250 μl di terreno contenente AraC.
nota: Le cellule possono essere utilizzate a partire da 6 giorni in vitro (DIV).
4. Deplezione selettiva della microglia (eseguita a 6 DIV)
- Aggiungere LME puro a 5 ml di un'aliquota separata di terreno MEM per ottenere una concentrazione finale di 150 mM LME.
- Riportare la soluzione a pH 7,4 e sterilizzare con filtro a siringa da 28 mm in polietere sulfone (PES) da 0,2 μm.
- Diluire la soluzione a una concentrazione di 50 mM (2 x LME) in terreno MEM e porre a bagnomaria a 37 oC per 10 minuti insieme al normale terreno MEM per colture di controllo.
- Prelevare metà (250 μl) del terreno MEM dalle colture CGC e conservarlo a 37 °C.
- Trattare le cellule con terreno MEM contenente 2 x LME (250 μl), cioè diluito 1:1 con una concentrazione di pozzetti di 25 mM, o con terreno MEM preriscaldato senza LME (250 μl) per le colture di controllo.
- Incubare le cellule a 37 °C in atmosfera umidificata con il 6% di CO2 per 1 ora.
- Lavare le cellule due volte in un terreno MEM fresco e preriscaldato per rimuovere i terreni contenenti LME, quindi sostituire il terreno di coltura trattenuto e un volume uguale di terreno MEM fresco preriscaldato nei pozzetti corrispondenti.
- Rimettere le colture nell'incubatore (umidificato con 6% di CO2 a 37 °C) e lasciare riposare per 24 ore prima di qualsiasi ulteriore trattamento.