Il protocollo per l'estrazione del tessuto cerebrale dai cuccioli di ratto Sprague Dawley del giorno 1, soppressi per decapitazione, è stato approvato dal Comitato per la cura e l'uso degli animali dell'Università di Alberta.
1. Isolamenti di microglia e astrociti
NOTA: Tutti i terreni per l'isolamento e la coltura cellulare vengono preriscaldati a 37 °C in un bagno d'acqua. La soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) contiene l'1% di penicillina-streptomicina (PS). Tutti i terreni Eagle's modificati di Dulbecco con la miscela di nutrienti F12 di Ham (DMEM/F12) sono integrati con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina (PS). Solo le miscele con tripsina sono prive di FBS. Tutti i materiali di questo protocollo sono sterili (filtro, alcol, acquistato e sterilizzato in autoclave) e ogni fase successiva alla fase numero 1.8 viene eseguita in una cappa di biosicurezza con tecnica asettica.
- Per cervello, preriscaldare 15 mL di HBSS e 12,5 mL di DMEM/F12 a 37 °C in provette da centrifuga coniche da 50 mL e circa 2 mL di tripsina allo 0,25% con 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Riscaldare altri 25 ml di DMEM/F12. Scaldare la tripsina circa 10 minuti prima dell'uso per evitare la perdita di attività enzimatica.
- Versare una quantità sufficiente di HBSS caldo in piatti sterili da 6 e 10 cm per coprire la superficie. Preparare un piatto da 10 cm ogni due cervelli più un altro piatto da 6 cm.
- Posizionare fino a 2 cervelli in ogni piatto da 10 cm2 (Figura 1A).
- Sotto un microscopio da dissezione, utilizzare una pinza curva e diritta per separare le cortecce lungo la linea mediana e il cervelletto con il tronco encefalico. Questo produce tre sezioni di tessuto per cervello (Figura 1B).
- Sbucciare il sottile strato semitrasparente (meningi) di tessuto contenente i vasi sanguigni da ciascuna sezione di tessuto e scartarlo, trasferendo il tessuto rimanente in un piatto di coltura separato. Afferrare gli strati sottili esposti dai tagli di tessuto, con la pinza, e tirare con cautela fino a quando le parti principali non "pendono" dal tessuto cerebrale. Infine rimuovere questa parte tirando delicatamente. Vedere la Figura 1C-1E per immagini rappresentative del prima, durante e dopo questo passaggio.
- In una cappa di biosicurezza, rimuovere l'HBSS rimanente dalla piastra di coltura, trattenendo accuratamente il tessuto. Macerare il tessuto con un bisturi e trasferire il tessuto nella provetta preriscaldata da 15 ml con tripsina.
- Incubare questa provetta per 25 minuti in un bagno a 37 °C per digerire enzimaticamente il tessuto.
- Centrifugare la provetta a 500 x g per 2 minuti a temperatura ambiente e versare il surnatante.
- Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, aggiungere 10 mL di DMEM/F12 caldo per inattivare la tripsina e triturare la soluzione 5 volte per rompere il tessuto.
- Centrifugare la provetta a 500 x g per 2 minuti a temperatura ambiente e versare il surnatante.
- Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, risospendere il pellet in 10 mL di DMEM/F12 caldo e trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga conica da 50 mL.
- Utilizzando una siringa da 10 ml con un ago calibro 18, triturare la soluzione 3 volte.
- Distribuire questa soluzione in incrementi di 12,5 mL di DMEM/F12 caldo per cervello.
- Pipettare incrementi di 1 mL della soluzione triturata in una piastra a 12 pozzetti (1 per cervello).
- Incubare a 37 °C e 5% di CO2 in un incubatore per colture cellulari umidificato. Sostituire i file multimediali dopo tre giorni e aggiornarli ogni tre giorni successivi. Dopo 2 settimane, le cellule possono essere raccolte per gli esperimenti.
2. Sintesi dei macromeri
- Pesare 375 mg di sale di acido ialuronico (HA) in una provetta da centrifuga conica da 50 ml e aggiungere 37,5 ml di acqua distillata.
- Sciacquare la soluzione con un vortice per 1 minuto e sonicare la miscela fino a quando non appare omogenea e perde la sua viscosità gelatinosa. Questo processo può richiedere 6 ore.
- Trasferire la soluzione in un becher da 100 mL con un'ancoretta magnetica (38 mm) e agitare energicamente a temperatura ambiente.
- Titolare con cautela 5,0 M di NaOH nell'HA di miscelazione e misurare con carta pH fino a quando il pH non si stabilizza tra 8 e 12.
- Raccogliere 3 mL di anidride metacrilico fresca (MA, 94%), ricoperta di azoto durante la conservazione.
nota: La MA è esposta all'atmosfera per lunghi periodi (giorni), perderà la sua reattività.
cautela: Tutto l'uso dell'MA deve essere effettuato in una cappa aspirante.
- Aggiungere 200 μl di MA nella soluzione di miscelazione di HA. La reazione abbassa il pH della soluzione al di sotto di 8.
- Ripetere i passaggi da 2.4 a 2.6 fino a quando i 3 mL di MA sono stati aggiunti alla soluzione. Questo processo può richiedere fino a 1-2 ore.
- Lasciare che la reazione continui per una notte a 4 °C, senza mescolare.
- Trasferire la soluzione in 400 mL di etanolo freddo (EtOH) in un becher da 500 mL e lasciare precipitare per 24 - 72 ore a 4 °C.
- Decantare con cura la maggior parte della soluzione in un becher separato per lo smaltimento e raccogliere il precipitato in una provetta da centrifuga conica da 50 mL. Questo può essere distribuito in 2-4 tubi, se necessario.
- Centrifugare le provette a 200 x g in una centrifuga per 2 minuti a temperatura ambiente e smaltire il surnatante.
- Rabboccare il tubo con EtOH freddo, mescolare la soluzione con un vortexer per 1 minuto e ripetere i passaggi 2.10-2.11.
- Aggiungere 25 mL di acqua deionizzata sterile, miscelare la soluzione con un vortexer per 1 minuto, sonicare (>20 kHz) per 1 ora e incubare a 4 °C per una notte.
- Mettere la soluzione in congelatore a -80 °C per 15 minuti o fino a quando non si congela o si congela rapidamente in azoto liquido.
cautela: Quando si utilizza l'azoto liquido, utilizzare guanti protettivi, una visiera e un grembiule.
- Liofilizzare il tubo (sotto 0,1 mBar e -30 °C) per 24 - 48 ore fino a quando non si produce una polvere simile alla neve.
- A questo punto, testare la purezza del campione tramite risonanza magnetica nucleare 1H, dove la quantità di protoni metacrilati (picchi a 6,1 e 5,6 ppm), rispetto ai protoni metilici (1,9 ppm), sulla spina dorsale HA può essere confermata. È accettabile un rapporto minimo del 95% tra metacrilato e protoni metilici.
3. Formazione di gel e incapsulamento 3D
- Presentazione e preparazione dello stampo
- Preparare una soluzione di acqua distillata da 50 ml di metacrilato di propile al 2% 3-(trimetossisilil) in una provetta da centrifuga conica da 50 ml.
- Mettere i vetrini coprioggetti da 18 mm in soluzione e agitare per 1 ora a temperatura ambiente. È possibile aggiungere fino a 50 vetrini coprioggetto contemporaneamente.
- Sciacquare i vetrini coprioggetti immergendoli in serie in 3 becher da 100 ml di acqua deionizzata.
- Asciugare i vetrini coprioggetti sottovuoto a 40 °C per una notte con essiccatore e forno.
- Immergere rapidamente i singoli vetrini coprioggetti in EtOH al 70% con una pinza.
- Senza asciugare, far cadere ogni vetrino coprioggetti in un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti.
- Lavare e aspirare ogni pozzetto con acqua deionizzata sterile (1 ml per pozzetto).
- Aggiungere 1 mL di poli-L-lisina (PLL) sterile da 2 μg/mL a ciascun pozzetto e incubare per >2 ore.
- Aspirare la soluzione PLL e lasciare asciugare i vetrini coprioggetti all'aria.
- Immergere gli stampi in polidimetilsilossano (PDMS) (vedere la Figura 2) in EtOH al 70% e posizionarne uno al centro di ciascun vetrino coprioggetti, quindi lasciare asciugare all'aria e creare una tenuta tra lo stampo e il vetro.
- Preparare gli stampi PDMS colando i reagenti premiscelati PDMS in un rapporto 10:1 in una capsula di polistirene a fondo piatto. La quantità di PDMS preparata viene selezionata in modo da ottenere un foglio di circa 1 mm di spessore. Per formare dei pozzetti nel PDMS, tagliare i fogli con un punzone circolare con un diametro interno di 10.
- Preparazione cellulare
NOTA: Tutte le fasi del protocollo vengono eseguite con tecnica sterile in una cappa di biosicurezza. La soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) viene regolata a pH 7,4 per tutte le fasi.
- 24 ore prima dell'incapsulamento cellulare in acido ialuronico metacrilato (HAMA), rinfrescare il terreno per le colture primarie di 2 settimane (dal passaggio 1.15) nelle piastre a 12 pozzetti. Aggiungere 1 mL di terreno DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) per pozzetto.
- Per ogni piastra di cellule a 12 pozzetti, preparare 12,5 mL di tripsina diluita (0,25% di tripsina-EDTA diluita al 30% con terreno DMEM/F12) e 25 mL di DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) e riscaldarla a 37 °C in bagnomaria.
- Raccogliere il terreno condizionato dalle piastre utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL (> 0,5 mL per pozzetto), aspirare accuratamente il liquido rimanente e sostituirlo con 1 mL per pozzetto di tripsina diluita (0,075% di tripsina-etilendiamminotetraacetico [EDTA]) per 20-30 minuti in un incubatore (37 °C, 5% CO2) fino a quando lo strato cellulare confluente non si stacca dalla piastra.
- Recuperare il materiale cellulare sospeso con una pipetta da 1 mL (appare come un singolo pezzo galleggiante) e raccoglierlo in una provetta da centrifuga conica da 15 mL. Diluire con un volume equivalente di DMEM/F12 (10% FBS e 1% PS) e centrifugare a 200 x g per 2 minuti a temperatura ambiente, scartando il surnatante.
- Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di DMEM/F12 caldo (10% FBS e 1% PS), triturare le cellule 5 volte con una pipetta da 10 mL e centrifugare a 200 x g per 2 min.
- Decantare il surnatante, risospendere le cellule in 5 mL di DMEM/F12 caldo e trasferire le cellule in una provetta da centrifuga conica da 50 mL.
- Utilizzando una siringa da 10 ml con un ago calibro 18, triturare la soluzione cellulare 3 volte e filtrare la sospensione attraverso un setaccio cellulare da 40 μm in una nuova provetta da centrifuga conica.
- Raccogliere 10 μl di sospensione cellulare, diluire 1:100 in DMEM/F12 caldo e contare le cellule con un contatore di cellule automatizzato.
- Incubare in un bagno d'acqua a 37 °C fino alla fase di incapsulamento.
- Incapsulamento cellulare
NOTA: Tutte le fasi del protocollo vengono eseguite con tecnica sterile in una cappa di biosicurezza.
- Per ogni piastra a 12 pozzetti di idrogel 3D, riscaldare 12,5 mL di DMEM/F12 e 12,5 mL di terreno DMEM/F12 condizionato raccolto durante la preparazione della cellula.
- Pesare la quantità di HAMA necessaria per una concentrazione finale dello 0,5% in peso/vol. Sciogliere questo HAMA in PBS filtrato sterile a una concentrazione di (2% in peso/vol); una concentrazione 4 volte superiore alla concentrazione finale viene utilizzata per accogliere l'aggiunta di cellule e altri reagenti. Una piastra a 12 pozzetti di idrogel richiede ~350 μL di PBS con 7 mg di HAMA.
- Sonicare le soluzioni (>20 kHz) fino a quando HAMA non è completamente disciolto per 60 minuti.
- Preparare singole soluzioni al 10% di trietanolammina (TEA) e 1-vinil-2-pirrolidinone (NVP) e una soluzione da 1 mM di eosina Y (EY) in aliquote da 1 mL di PBS sterile pH 7,4.
- Per una piastra da 12 pozzetti, preparare una miscela finale da 1,4 mL di 1 x 107 cellule, 0,5% in peso/vol di HAMA (350 μL di 2% in peso/vol), 0,1% di TEA (14 μL di 10%), 0,1% di NVP (14 μL di 10%) e 0,01 mM EY (14 μL di 1 mM) e 20% di miscela di lamina basale (280 μL di madre). Il volume rimanente è PBS.
- Miscelare delicatamente la soluzione e pipettare 100 μl in ogni stampo PDMS con un puntale da 1 mL.
- Esporre i campioni a una luce LED verde ad alta intensità (~520 nm, 60 mW, in una scatola chiusa di 20 cm x 20 cm x 20 cm) per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Aggiungere 1 mL per pozzetto di DMEM/F12 condizionato caldo a una piastra da 12 pozzetti.
- Afferrare ogni vetrino coprioggetti tra il pollice e l'indice, staccare lentamente lo stampo PDMS con una pinzetta curva facendo attenzione a non spostare il gel e metterlo in un pozzetto con mezzo condizionato.
- Aggiungere un ulteriore 1 mL di DMEM/F12 caldo a ciascun pozzetto.
- Incubare le piastre a 37 °C con CO2 al 5% per 2 settimane, rinfrescando i terreni cellulari ogni settimana pipettando 1 mL di terreno da ciascun pozzetto e sostituendoli con 1 mL di DMEM/F12.
