Generazione e mantenimento di astrosfere utilizzando cellule staminali pluripotenti umane

Abstract

Source: Cvetkovic, C., et al. Modellazione di microcircuiti sinaptici con cocolture 3D di astrociti e neuroni da cellule staminali pluripotenti umane. (2018).

Il video dimostra un metodo per generare astrosfere da progenitori da cellule staminali pluripotenti umane. Coinvolge la crescita e la proliferazione di cellule staminali con mezzi nutritivi contenenti fattori di crescita e inibitori delle chinasi. Queste cellule poi si aggregano e si differenziano in astrociti, formando astrosfere.

Protocol

1. Coltura cellulare e preparazione dei reagenti

1. Preparare le piastre rivestite per la coltura cellulare.
   1. Diluire la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) con terreni DMEM/F12 per preparare una soluzione madre da 1 mg/mL. Aliquotare la soluzione madre ECM diluita in 30 provette coniche da 3 mL ciascuna e conservarla immediatamente a -20 °C. Per una soluzione funzionante, risospendere 3 mL di stock ECM in 33 mL di terreno DMEM/F12 pre-raffreddato, portando il volume totale a 36 mL per una concentrazione di 80 μg/mL.
   2. Rivestire 1 mL per pozzetto di una piastra per colture cellulari a 6 pozzetti co....

Results

Figura 1: Rappresentazione graduale della differenziazione e della formazione di sfere neurali 3D derivate da hPSC. (A) Cronologia delle fasi chiave del protocollo. (B) Popolazioni pure di cellule neurali possono essere generate da cellule staminali pluripotenti indotte umane (hPSC). Per la generazione dei progenitori degli astrociti (riquadro verde tratteggiato), vedere il passaggio 2.1. (C) I neuro.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piastra a 6 pozzetti	Fisher Scientifico	08-772-1B
Tubi conici da 15 ml	Olympus Plastics	28-101
Accutase	sigma	A6964-100ML	Soluzione di distacco
Piastra AggreWell	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 34850
Soluzione di risciacquo antiaderente	Tecnologie delle cellule staminali	7010	Prevenire l'adesione delle cellule alle piastre a micropozzetti
Anti/anti	Thermofisher	15240062
B27	Thermofisher	17504044	Supplemento per i media
Mezzo neuronale BrainPhys	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 5790	Alternativa al mezzo basale neurofisiologico
Criostore CS10	Tecnologie delle cellule staminali	7930	Terreno di crioconservazione con il 10% di DMSO
DMEM/F12	Thermofisher	Codice 10565-042	Con integratore GlutaMAX
DMH-1	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 73634	PERICOLO: Tossico se ingerito. Concentrazione di lavoro: 2 uM
Doxiciclina cloridrato (Dox)	sigma	D3072-1ml	PERICOLO: Tossico per le donne in gravidanza. Concentrazione di lavoro: 2 ug/mL
Fattore di crescita epidermico (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Concentrazione di lavoro: 10 ng/mL
Fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF)	Peprotech	100-18B	Concentrazione di lavoro: 10 ng/mL
Emocitometro o contatore automatico di cellule	Tecnologie per la vita	AMQAX1000
Matrice a membrana Matrigel	Corning	Codice 354230	Soluzione di rivestimento ECM. Concentrazione di lavoro: 80 ug/ml. Preparare con ghiaccio e assicurarsi che pipette, provette e terreni siano pre-raffreddati.
Soluzione di montaggio
N2	Thermofisher	17502048	Supplemento per i media
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Tecnologie delle cellule staminali	CA008-300
ReLeSR	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 5872	Reagente di distacco e passaggio
Inibitore della Rho-chinasi Y27632- (Y)	Tocris	Ore 1254	Concentrazione di lavoro: 10 uM
SB431542	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 72234	Concentrazione di lavoro: 2 uM
Fiaschetta di coltura T25	Olympus Plastics	25-207	Tappi ventilati
Pallone di coltura T75	Olympus Plastics	25-209	Tappi ventilati