$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Coltura cellulare e preparazione dei reagenti
- Preparare le piastre rivestite per la coltura cellulare.
- Diluire la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) con terreni DMEM/F12 per preparare una soluzione madre da 1 mg/mL. Aliquotare la soluzione madre ECM diluita in 30 provette coniche da 3 mL ciascuna e conservarla immediatamente a -20 °C. Per una soluzione funzionante, risospendere 3 mL di stock ECM in 33 mL di terreno DMEM/F12 pre-raffreddato, portando il volume totale a 36 mL per una concentrazione di 80 μg/mL.
- Rivestire 1 mL per pozzetto di una piastra per colture cellulari a 6 pozzetti con soluzione di lavoro ECM. Aggiungere un ulteriore 1 mL di DMEM/F12 per pozzetto (se necessario) per assicurarsi che la superficie del pozzetto sia completamente coperta. Lasciare riposare le piastre di coltura cellulare rivestite a 6 pozzetti a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.
NOTA: Le piastre rivestite possono essere conservate nell'incubatrice o a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare formulazioni di terreni, fattori di crescita e piccole molecole.
- Per preparare 500 ml di terreno di coltura con cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), aggiungere 20x e 500x integratori secondo le istruzioni del produttore.
- Per preparare 500 ml di mezzo neurale (NM), aggiungere eparina a una concentrazione finale di 2 mg/mL, 1 volta di soluzione antibiotica/antimicotica, 1 integratore di B27 o 1 integratore di N2 a un flacone da 500 ml di DMEM/F12 con integratore di L-glutammina, come precedentemente dettagliato.
- Per preparare una soluzione madre 10 mM (1.000x) dell'inibitore della Rho-chinasi Y27632 (Y), aggiungere 10 mg di polvere in 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Filtrare, sterilizzare, aliquotare e conservare a -20 °C. Utilizzare a una concentrazione di lavoro di 10 μM in fluidi.
- Per preparare una soluzione madre 20 mM (10.000x) di SB431542, aggiungere 10 mg di polvere in 1,3 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Per preparare una soluzione madre 2 mM (1.000x) di DMH1, aggiungere 10 mg di polvere in 13,1 mL di DMSO. Filtrare, sterilizzare, aliquotare e conservare ciascuna soluzione a -20 °C. Utilizzare ciascuna a una concentrazione di lavoro di 2 μM in mezzi (NM + SB431542 + DMH1).
nota: Questo protocollo raccomanda concentrazioni di lavoro di 2 μM sia di SB431542 che di DMH1 sulla base delle nostre osservazioni e dei rapporti di altri che affermano che questa concentrazione promuove efficacemente l'induzione neurale dalle hPSC. Sono state segnalate anche concentrazioni più elevate30. Inoltre, con i mezzi alternativi, è stato dimostrato che le piccole molecole non sono necessarie per un'elevata conversione neurale. Pertanto, le concentrazioni di lavoro variano a seconda degli ambienti di coltura cellulare alternativi e le concentrazioni ottimali dovrebbero essere testate dai singoli ricercatori.
- Per preparare singole soluzioni stock da 100 μg/mL (10.000x) di fattore di crescita epidermico (EGF) e fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF2), aggiungere 1 mg di ciascuno in 10 mL di PBS + 0,1% BSA. Aliquotare le soluzioni madre di EGF e FGF2 in aliquote da 50 μl e conservare a -80 °C. Utilizzare ciascuna di esse a una concentrazione di lavoro di 10 ng/mL in terreno; ad esempio, aggiungere 5 μL di EGF e 5 μL di FGF2 a 50 mL di NM (NM + EGF + FGF2).
- Per preparare una soluzione madre di doxiciclina cloridrato (Dox), sciogliere prima la polvere in DMSO a 100 mg/mL e conservare a -20 °C. Inoltre, diluirlo per ottenere una soluzione madre di 2 mg/mL (1.000x) in PBS e conservare a -20 °C. Utilizzare a una concentrazione di lavoro di 2 μg/mL in terreni; ad esempio, aggiungere 50 μL di Dox a 50 mL di NM (NM + Dox).
nota: Non ricongelare le soluzioni dopo lo scongelamento.
2. Generazione di sottotipi neurali da cellule pluripotenti indotte umane (hPSC)
NOTA: Tutte le colture cellulari devono essere conservate in un incubatore con il 5% di CO2 a 37 °C. Queste colture vengono mantenute a livelli di ossigeno nella stanza, anche se possono essere utilizzati livelli più bassi.
- Generare e mantenere progenitori astrocitari (hAstros) da hPSCs.
nota: In questa sezione viene fornito un protocollo di differenziazione breve e semplificato. Per una descrizione dettagliata (con la formazione del corpo embrioide, la selezione della rosetta e le fasi di patterning regionale), fare riferimento al protocollo precedentemente descritto (Figura 1A, riquadro verde tratteggiato).
- Seminare gruppi di hPSC (Figura 1B) su piastre a 6 pozzetti rivestite con ECM (vedere il passaggio 1.1) con 2 mL di terreno hPSC + Y per pozzetto. Nutri le cellule staminali ogni giorno fino a quando non sono circa il 50% confluenti e divise secondo necessità.
- Per scindere le hPSC, aggiungere 1 mL di reagente passante ai pozzetti e aspirare dopo 1 minuto. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 minuti, aggiungere 1 mL di terreno hPSC e dividere gli aggregati 1:10 su nuovi pozzetti rivestiti di ECM in 2 mL di terreno hPSC + Y per pozzetto.
- Mantenere le cellule staminali fino a quando non sono confluenti per circa il 50%, quindi cambiare il terreno in NM + SB431542 + DMH1 per indurre la differenziazione neurale (giorno 0). Quando le cellule sono confluenti per circa il 95%, dividere 1:6 in nuovi pozzetti rivestiti di ECM nello stesso terreno.
- Il giorno 14, dissociare le cellule con la soluzione di distacco e trasferirle in un pallone non rivestito con Y per favorire la formazione di aggregati.
nota: L'aggiunta di Y viene utilizzata per promuovere la sopravvivenza cellulare e la formazione di sfere, ma non è inclusa durante ogni alimentazione.
- Per la generazione di progenitori neuronali e neuroni (hNeurons), utilizzare queste cellule del giorno 14 come descritto di seguito. In alternativa, utilizzare queste cellule in momenti successivi da colture monostrato o sferiche prima che si verifichi la maturazione neuronale o inizi la gliogenesi.
nota: Per impostazione predefinita, questo protocollo produce astrociti corticali dorsali. Tuttavia, i sottotipi di astrociti possono essere specificati a livello regionale con l'aggiunta di morfogeni di patterning, se lo si desidera. L'acido retinoico (RA) può essere aggiunto per caudalizzare le cellule in fenotipi del midollo spinale, mentre il riccio sonico (SHH), l'agonista levigato (SAG) o la purmorfemina produrranno fenotipi ventrali.
- Per la generazione di progenitori astrocitari e astrociti in aggregati 3D formati spontaneamente (hAstrospheres), passare a NM + EGF + FGF2 e somministrare settimanalmente (o secondo necessità per garantire un pH stabile) come precedentemente dettagliato.
- Dissociare delicatamente gli aggregati hAstro con la soluzione di distacco quando compaiono i centri oscuri e rimuovere le sfere che si attaccano spontaneamente. Rompi delicatamente le sfere una volta alla settimana per mantenere la salute delle sfere ed evitare nuclei necrotici.
nota: Non superare i 5 minuti di trattamento con soluzione di distacco.
- Dopo 4-6 mesi di espansione, confermare l'identità della cellula e congelarla in mezzo di crioconservazione (secondo le istruzioni del produttore) o in condizioni di conservazione alternative per la conservazione a lungo termine in azoto liquido o utilizzare immediatamente per la sperimentazione.
