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Sono state ottenute approvazioni etiche durante l'esecuzione degli esperimenti.
1. Coltura cellulare e preparazione dei reagenti
- Preparare le piastre rivestite per la coltura cellulare.
- Diluire la soluzione di rivestimento della matrice extracellulare (ECM) con il terreno Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) di Dulbecco per preparare una soluzione madre da 1 mg/mL. Aliquotare la soluzione madre ECM diluita in 30 provette coniche da 3 mL ciascuna e conservarla immediatamente a -20 °C. Per una soluzione funzionante, risospendere 3 mL di stock ECM in 33 mL di terreno DMEM/F12 pre-raffreddato, portando il volume totale a 36 mL per una concentrazione di 80 μg/mL.
- Rivestire 1 mL per pozzetto di una piastra per colture cellulari a 6 pozzetti con soluzione di lavoro ECM. Aggiungere un ulteriore 1 mL di DMEM/F12 per pozzetto (se necessario) per assicurarsi che la superficie del pozzetto sia completamente coperta. Lasciare riposare le piastre di coltura cellulare rivestite a 6 pozzetti a temperatura ambiente per almeno 1 ora prima dell'uso.
nota: Le piastre rivestite possono essere conservate nell'incubatore o a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare formulazioni di terreni, fattori di crescita e piccole molecole.
- Per preparare 500 ml di terreno di coltura con cellule staminali pluripotenti umane (hPSC), aggiungere 20x e 500x integratori secondo le istruzioni del produttore.
- Per preparare 500 ml di mezzo neurale (NM), aggiungere eparina a una concentrazione finale di 2 mg/mL, 1 volta di soluzione antibiotica/antimicotica, 1 integratore di B27 o 1 integratore di N2 a un flacone da 500 ml di DMEM/F12 con integratore di L-glutammina, come precedentemente dettagliato.
- Per preparare una soluzione madre da 10 mM (1.000x) dell'inibitore della Rho-chinasi Y27632 (Y), aggiungere 10 mg di polvere in 3 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Sterilizzare, aliquotare e conservare a -20 °C. Utilizzare a una concentrazione di lavoro di 10 μM in terreni.
- Per preparare una soluzione madre 20 mM (10.000x) di SB431542, aggiungere 10 mg di polvere in 1,3 mL di dimetilsolfossido (DMSO). Per preparare una soluzione madre 2 mM (1.000x) di DMH1 (4-[6-(4-isopropoxyphenil)pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]chinolina, 4-[6-[4-(1-metiletossi)fenil]pirazolo[1,5-a]pirimidin-3-il]-chinolina), aggiungere 10 mg di polvere in 13,1 mL di DMSO. Filtrare, sterilizzare, aliquotare e conservare ciascuna soluzione a -20 °C. Utilizzare ciascuna a una concentrazione di lavoro di 2 μM in terreni (NM + SB431542 + DMH1).
nota: Questo protocollo raccomanda concentrazioni di lavoro di 2 μM sia di SB431542 che di DMH1 sulla base delle nostre osservazioni e dei rapporti di altri che affermano che questa concentrazione promuove efficacemente l'induzione neurale dalle hPSC. Sono state segnalate anche concentrazioni più elevate. Inoltre, con i mezzi alternativi, è stato dimostrato che le piccole molecole non sono necessarie per un'elevata conversione neurale. Pertanto, le concentrazioni di lavoro variano a seconda degli ambienti di coltura cellulare alternativi e le concentrazioni ottimali dovrebbero essere testate dai singoli ricercatori.
- Per preparare una soluzione madre di doxiciclina cloridrato (Dox), sciogliere prima la polvere in DMSO a 100 mg/mL e conservare a -20 °C. Diluito ulteriormente per ottenere una soluzione madre di 2 mg/mL (1.000x) in PBS e conservarlo a -20 °C. Utilizzare a una concentrazione di lavoro di 2 μg/mL in terreni; ad esempio, aggiungere 50 μL di Dox a 50 mL di NM (NM + Dox).
nota: Non ricongelare le soluzioni dopo lo scongelamento.
2. Generazione di sottotipi neurali da cellule pluripotenti indotte umane (hPSC)
NOTA: Tutte le colture cellulari devono essere mantenute in un incubatore con il 5% di CO2 a 37 °C. Queste colture vengono mantenute a livelli di ossigeno nella stanza, anche se possono essere utilizzati livelli più bassi.
- Generare e mantenere progenitori astrocitari (hAstros) da hPSC.
nota: In questa sezione viene fornito un protocollo di differenziazione breve e semplificato. (Figura 1A, riquadro verde tratteggiato).
- Seminare gruppi di hPSC (Figura 1B) su piastre a 6 pozzetti rivestite con ECM con 2 mL di terreno hPSC + Y per pozzetto. Nutri le cellule staminali ogni giorno fino a quando non sono circa il 50% confluenti e divise secondo necessità.
- Per scindere le hPSC, aggiungere 1 mL di reagente passante ai pozzetti e aspirare dopo 1 minuto. Incubare le cellule a temperatura ambiente per 5 minuti, aggiungere 1 mL di terreno hPSC e dividere gli aggregati 1:10 su nuovi pozzetti rivestiti di ECM in 2 mL di terreno hPSC + Y per pozzetto.
- Mantenere le cellule staminali fino a quando non sono confluenti per circa il 50%, quindi cambiare il terreno in NM + SB431542 + DMH1 per indurre la differenziazione neurale (giorno 0). Quando le cellule sono confluenti per circa il 95%, dividere 1:6 in nuovi pozzetti rivestiti di ECM nello stesso terreno.
- Il giorno 14, dissociare le cellule con la soluzione di distacco e trasferirle in un pallone non rivestito con Y per favorire la formazione di aggregati.
nota: L'aggiunta di Y viene utilizzata per promuovere la sopravvivenza cellulare e la formazione di sfere, ma non è inclusa durante ogni alimentazione.
- Per la generazione di progenitori neuronali e neuroni (hNeurons), utilizzare queste cellule del giorno 14 per differenziarsi come descritto per le cellule transgeniche.
- Generare e mantenere neuroni inducibili (iNeurons) da hPSC.
- Seme di hPSC transgeniche (con un transgene stabile della neurogenina 2 inducibile dalla doxiciclina) su piastre a 6 pozzetti rivestite con ECM con 2 mL di terreno hPSC + Y per pozzetto (come descritto sopra per le linee non transgeniche). Somministrare ogni giorno con 2 mL di terreno per pozzetto fino a quando non sono pronti per il sollevamento al 70% di confluenza. Dividi le celle come descritto sopra.
- Quando le cellule sono confluenti per circa il 35%, aggiungere NM + Dox per indurre la differenziazione in iNeurons.
nota: Le cellule passeranno in progenitori neuronali, ma non estenderanno ancora i neuriti.
