Generazione di sfere di co-coltura 3D di astrociti e neuroni per indurre la formazione di sinapsi

Abstract

Fonte: Cvetkovic, C., et al. Modellazione di Microcircuiti Sinaptici con Cocolture 3D di Astrociti e Neuroni da Cellule Staminali Pluripotenti Umane. J. Vis. Exp. (2018).

Questo video mostra una procedura per co-coltivare gli astrociti e i neuroni per formare sfere 3D. Queste sfere 3D forniscono una piattaforma distinta per esaminare la formazione delle sinapsi e l'integrazione delle reti neurali, fungendo così da potenziale modello per la ricerca nelle neuroscienze dello sviluppo, nelle malattie neurodegenerative e negli interventi neurofarmacologici.

Protocollo

1. Preparazione e manutenzione di cocolture di sfere 3D

1. Dissociare gli hAstros dagli aggregati 3D in sospensione.​
   1. Dissociare delicatamente gli aggregati di astrociti umani (hAstro) con la soluzione di distacco quando compaiono i centri oscuri e rimuovere le sfere che si attaccano spontaneamente. Rompi delicatamente le sfere una volta alla settimana per mantenere la salute delle sfere ed evitare nuclei necrotici.
      NOTA: Non superare i 5 minuti di trattamento con soluzione di distacco.
2. Dissociare hNeurons o iNeurons da un monostrato 2D.
   1. Rimuovere il terreno dalla piastra a 6 pozzetti e aggiungere 500 μL di soluzione di distacco a ciascuna coltura monostrato contenente pozzetti di hNeuron (neurone umano) o iNeurons (neuroni inducibili). Incubare a 37 °C per 5 min. Aggiungere delicatamente 2-3 mL di terreno basale DMEM/F12 per rimuovere le cellule attaccate.
   2. Raccogliere le cellule e i terreni in una provetta conica da 15 ml e centrifugare a 300 x g per 1 minuto. Aspirare il surnatante, aggiungere 1 ml di terreno fresco e pipettare delicatamente su e giù con una micropipetta da 1.000 μl per ottenere una sospensione di una singola cellula.
3. Forma sfere 3D utilizzando piastre di coltura a micropozzetti.
   1. Preparare la piastra aggiungendo 0,5 ml di soluzione di risciacquo antiaderente a ciascun pozzetto della piastra per micropozzetti. Centrifugare la piastra a 2.000 x g per 5 min. Aspirare la soluzione di risciacquo, aggiungere 1 mL di terreno basale DMEM/F12 a ciascun pozzetto per lavare e aspirare nuovamente.
      nota: Assicurarsi sempre che la centrifuga sia bilanciata durante l'uso.
   2. Conta ogni tipo di cellula utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Aggiungere il rapporto desiderato di hAstros dissociati e hNeurons o iNeurons a ciascun pozzetto in un volume totale di 2 mL di mezzo neurale (NM) + Y (includere Dox se vengono utilizzati iNeurons). Centrifugare la piastra a 100 x g per 3 minuti e rimetterla nell'incubatore.
      NOTA: le piastre per micropozzetti da 24 pozzetti (vedere la Tabella dei materiali) contengono 300 micropozzetti per pozzetto. Aggiungere un minimo di 6 x 10⁵ celle (per sfere da 2 x 10³ celle ciascuna) e un massimo di 6 x 10⁶ celle (per sfere da 2 x 10⁴ celle ciascuna) in 2 mL di terreno per pozzetto. Per le sfere vitali di una densità specifica all'interno di questo intervallo, utilizzare una quantità definita di celle e dividere per 300 per calcolare il numero di celle per sfera. Se lo si desidera, possono essere utilizzati anche metodi e strumenti alternativi per la formazione di sfere. Seguire le istruzioni del produttore per intervalli accettabili di densità delle celle.
   3. Lasciare che le cellule si autoassemblino in sfere densamente impacchettate all'interno di piastre a micropozzetti nei prossimi 2 giorni (Figura 1A). Sostituire il 50% dei terreni se la coltura è ingiallita.
      nota: Sostituire solo metà del terreno e pipettare delicatamente quando si rimuove e si aggiunge il terreno per non disturbare le sfere. Le sfere possono sollevarsi dai micropozzetti e fondersi insieme con una forza maggiore.
   4. Dopo 2 giorni, rimuovere delicatamente le sfere dai micropozzetti con una micropipetta da 1.000 μl (Figura 2D). Applicare leggermente la forza sul fondo dei micropozzetti con il terreno per rimuovere eventuali sfere aderenti aggiuntive. Lasciare riposare le sfere in una provetta conica da 15 mL, aspirare il vecchio terreno e aggiungere il terreno nuovo.
4. Configura il sistema di bioreattore a fiaschetta per la formazione di sfere 3D.​
   1. Pulire la superficie di una piastra di agitazione magnetica con etanolo al 70% e inserirla in un incubatore per colture cellulari. Autoclave singole palle rotanti per sterilizzare.
   2. Aggiungere sfere con un minimo di 50-60 mL di terreno a ciascun pallone rotante (Figura 2D, riquadro). Posizionare il pallone sulla piastra di agitazione magnetica impostata a 60 giri/min. Sfere di coltura in palloni rotanti fino a quando non sono pronte per la raccolta dei dati.
      nota: Per la formazione delle sinapsi sono necessarie almeno 3 settimane di coltura.

Risultati

Figura 1: Generazione sistematica e riproducibile di sfere neurali 3D bioingegnerizzate. (A) Le piastre di coltura a micropozzetti (μ pozzetti) vengono utilizzate per formare sfere neurali 3D della densità desiderata e dei rapporti neurone-astrocita in modo sistematico e specificato dall'utente, ottenendo dimensioni e forma coerenti. Le immagini vengono mostrate 1 giorno dopo la form...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastra a 6 pozzetti	Fisher Scientifico	08-772-1B
Tubi conici da 15 ml	Olympus Plastics	28-101
Accutase	sigma	A6964-100ML	Soluzione di distacco
Piastra AggreWell	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 34850
Soluzione di risciacquo antiaderente	Tecnologie delle cellule staminali	7010	Prevenire l'adesione delle cellule alle piastre a micropozzetti
Anti/anti	Thermofisher	15240062
B27	Thermofisher	17504044	Supplemento per i media
Mezzo neuronale BrainPhys	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 5790	Alternativa al mezzo basale neurofisiologico
DMEM/F12	Thermofisher	Codice 10565-042	Con integratore GlutaMAX
DMH-1	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 73634	PERICOLO: Tossico se ingerito. Concentrazione di lavoro: 2 uM
Siero d'asino	Laboratori Biologici Lampire	Codice: 7332100	Concentrazione di lavoro: 5% nel tampone di blocco primario, 1% nel tampone di blocco secondario
Doxiciclina cloridrato (Dox)	sigma	D3072-1ml	PERICOLO: Tossico per le donne in gravidanza. Concentrazione di lavoro: 2 ug/mL
Fattore di crescita epidermico (EGF)	Peprotech	AF-100-15	Concentrazione di lavoro: 10 ng/mL
Fattore di crescita dei fibroblasti-2 (FGF)	Peprotech	100-18B	Concentrazione di lavoro: 10 ng/mL
Emocitometro o contatore automatico di cellule	Tecnologie per la vita	AMQAX1000
Matrice a membrana Matrigel	Corning	Codice 354230	Soluzione di rivestimento ECM. Concentrazione di lavoro: 80 ug/ml. Preparare con ghiaccio e assicurarsi che pipette, provette e terreni siano pre-raffreddati.
Sistema MEA 2100	Sistemi multicanale	MEA2100
Inibitore della Rho-chinasi Y27632- (Y)	Tocris	Ore 1254	Concentrazione di lavoro: 10 uM
SB431542	Tecnologie delle cellule staminali	Codice: 72234	Concentrazione di lavoro: 2 uM
Palloni rotanti	Fisher Scientifico	4500-125
Fiaschetta di coltura T25	Olympus Plastics	25-207	Tappi ventilati
Tripan blu	Invitrogen	T10282