Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione delle colture MSC per ratti
- Prelievo di MSC dal femore
- Autoclavare in autoclave tutti gli strumenti di dissezione (ad es. forbici da dissezione fine, forbici da taglio a punta smussata e pinze dentate) a 180 °C per almeno 2 ore prima dell'uso.
- Preparare un terreno di crescita MSC composto da un terreno essenziale minimo - modificazione alfa (αMEM) integrato con il 15% di siero fetale bovino (FBS) e penicillina/streptomicina (P/S, 1% v/v).
- Sacrificare giovani ratti maschi Sprague Dawley (200-250 g di peso corporeo) mediante sovradosaggio di pentobarbitone (240 mg/kg di peso corporeo, intraperitoneale).
nota: I campioni di midollo di ratti diversi devono essere trattati separatamente.
- Posizionare gli animali sacrificati in posizione supina. Pulire accuratamente l'addome e gli arti inferiori con etanolo al 70%.
- Rimuovere la pelle e il tessuto sottocutaneo sopra le cosce mediali utilizzando forbici da dissezione e pinze sottili. Rimuovere i muscoli della coscia circonferenzialmente fino a quando il femore non è esposto. Continua a farlo prossimalmente e distalmente fino a quando non si vedono le articolazioni del ginocchio e dell'anca. Disarticolare il femore attraverso l'articolazione dell'anca e del ginocchio utilizzando le forbici da taglio a punta smussata.
nota: Non sezionare il femore per esporre la cavità midollare in questa fase. Trasferire i femori intatti in una cappa di coltura tissutale a flusso laminare per un'ulteriore elaborazione.
- Usa le forbici da taglio a punta smussata per sezionare le estremità distale e prossimale del femore attraverso la metafisi.
- Posizionare un filtro cellulare da 70 μm su una provetta conica da 50 mL. Inserire una siringa da 21 G, 10 mL contenente soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) nel canale femorale esposto e lavare il contenuto del midollo nella provetta conica mediante lavaggio ripetuto.
nota: Circa 20 ml di PBS vengono utilizzati per il lavaggio di ciascun femore. Se il colore del contenuto lavato rimane macchiato di sangue e torbido, è possibile utilizzare un volume maggiore.
- Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 480 x g per 5 min. Scartare il surnatante. Risospendere il pellet cellulare in 10 mL di terreno di crescita MSC. Placcare le cellule su una piastra di coltura tissutale di 10 cm. Collocare le piastre di coltura tissutale in un incubatore cellulare (37 °C, 5% CO2). Registrare il giorno iniziale di placcatura come giorno 0,
nota: In tutte le fasi che prevedono la centrifugazione, impostare il freno per la massima decelerazione.
- Costituzione ed espansione delle colonie MSC
nota: Questo protocollo si basa sull'aderenza plastica della coltura tissutale per selezionare le MSC all'interno della cavità midollare. Il contenuto del midollo osseo può aderire alla plastica di coltura tissutale per 2 giorni.
- Il giorno 2, sciacquare tre volte le piastre di coltura con 10 ml di PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Sostituire il PBS con 10 ml di terreno di coltura MSC dopo il risciacquo. Lavare le cellule con PBS e reintegrarle con terreno di crescita MSC ogni 3 giorni.
nota: Le colonie di MSC dovrebbero essere visibili entro il giorno 6-7 (Figura 1A).
- Passare le cellule entro il giorno 10 rimuovendo il terreno di crescita e risciacquando le cellule con PBS. Aggiungere 1,5 mL di reagente di dissociazione cellulare enzimatica ricombinante e incubare a 37 °C per 5 minuti. Aggiungere 3 mL di terreno di crescita MSC per neutralizzare la reazione. Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione a 250 x g per 5 min.
- Quantificare le cellule all'interno del pellet utilizzando un emocitometro dopo un'appropriata diluizione in PBS.
- Il seme ha fatto passare le cellule a una densità di 40.000 cellule/cm2 in una piastra di coltura di 10 cm in un terreno di crescita MSC.
nota: Le MSC di ratto dovrebbero raggiungere l'80-90% di confluenza entro 2 giorni dal passaggio (Figura 1B). Le celle possono essere fatte passare come descritto nel passaggio 1.2.2 per un massimo di 8 passaggi. Le MSC possono essere caratterizzate utilizzando l'immunocitochimica e la loro capacità di differenziazione trilineare (Figura 2). Solo le colture di MSC tra i passaggi 3 e 8 sono soggette a successivo precondizionamento ipossico e arricchimento dei progenitori neurali. Le MSC di maggior numero di passaggi adottano una morfologia appiattita (Figura 1C) e non producono sufficienti progenitori neurali. Queste culture dovrebbero essere scartate.
2. Preparazione delle Culture BMSC Umane
- Diluire 1 mL di aspirato di midollo osseo umano con 9 mL di terreno di crescita MSC e piastrarle su un piatto di coltura tissutale di 10 cm. Mantenere le colture in un incubatore cellulare (37 °C, 5% CO2).
- Rimuovere il terreno dopo 2 giorni e sciacquare delicatamente le colture tre volte con 10 ml di PBS per rimuovere le cellule non aderenti. Dopo l'ultimo risciacquo, rimuovere il PBS e sostituirlo con 10 ml di terreno di coltura MSC. Reintegrare il terreno di coltura ogni 3 giorni di coltura dopo il risciacquo PBS.
nota: Le colonie di MSC dovrebbero essere visibili entro il giorno 6-7. Il numero di colonie può variare da soggetto a soggetto.
- Passaggio delle celle il giorno 10, come descritto nel passaggio 1.2.2. Quantificare le cellule all'interno del pellet utilizzando un emocitometro dopo un'appropriata diluizione in PBS. Seminare le cellule passate a 40.000 cellule/cm2 di densità su una piastra di coltura di 10 cm in un terreno di crescita MSC.
nota: Le MSC umane (Figura 1D) dimostrano una morfologia simile alle MSC di ratto e dovrebbero raggiungere l'80-90% di confluenza entro 2 giorni dal passaggio. Dovrebbero essere caratterizzati utilizzando l'immunocitochimica e la loro capacità di differenziazione trilineare. Come per le MSC di ratto, le MSC umane tra i passaggi 3 e 8 sono soggette a successivo precondizionamento ipossico e arricchimento dei progenitori neurali.
3. Precondizionamento ipossico
- Smontare i componenti della camera di ipossia (cioè base, coperchio, vassoi) dopo aver rilasciato l'anello clamp e pulire le singole parti con etanolo al 70%. Posizionare i componenti della camera all'interno di una cappa di coltura tissutale a flusso laminare per la sterilizzazione sotto luce UV per 15 minuti.
- Prima del precondizionamento ipossico, rimuovere il terreno e sciacquare le colture di MSC di ratto e umane (sezioni 1 e 2) con 10 ml di PBS. Sostituire il PBS con 10 mL di terreno di crescita MSC integrato con 25 mM di HEPES.
nota: Le MSC coltivate su piastre di 10 cm devono aver raggiunto l'80-90% di confluenza prima di essere sottoposte a precondizionamento ipossico.
- Posizionare i piatti di coltura all'interno della camera di ipossia. Rimontare i componenti della camera e serrare l'anello clamp. Versare una miscela di gas al 99% N2/1% O2 nella camera a una portata di 10 L/min per 5 minuti.
- Sigillare le estremità di collegamento della camera di ipossia per garantire l'assenza di perdite di gas. Posizionare la camera all'interno dell'incubatore cellulare (37 °C, 5% CO2) per 16 ore.
- Al termine del precondizionamento ipossico, rimuovere le colture dalla camera in preparazione per la successiva coltura di arricchimento dei progenitori neurali.
4. Cultura dell'arricchimento dei progenitori neurali
- Preparare il terreno progenitore neurale composto dalla miscela di nutrienti F12 (DMEM/F12) di Dulbecco modificata con B27 (2% v/v), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF, 20 ng/mL), fattore di crescita epidermico (EGF, 20 ng/mL) e P/S (1% v/v).
- Staccare le MSC ipossiche precondizionate di ratto/uomo, come descritto al punto 1.2.2. Raccogliere le cellule staccate mediante centrifugazione a 250 x g per 5 min. Quantificare le cellule all'interno del pellet utilizzando un emocitometro dopo un'appropriata diluizione in PBS.
- Risospendere le cellule nel terreno progenitore neurale e seminare su piastre a 6 pozzetti a basso attaccamento a una densità di 6.000 cellule/cm2. Porre la coltura in un incubatore cellulare (37 °C, 5% CO2) per 12 giorni. Reintegrare il 75% del mezzo progenitore neurale ogni 3 giorni.
nota: Entro i giorni 6-7 si dovrebbero osservare ammassi cellulari non aderenti di grandi dimensioni. Entro il giorno 10-12 si possono osservare neurosfere con un diametro ≥ 100 μm (Figura 3). Le MSC ipossiche precondizionate dovrebbero produrre più neurosfere rispetto alle MSC coltivate in condizioni normossiche.
- Raccogliere le neurosfere il giorno 12 aspirandole in una pipetta da 10 ml e trasferendole in una provetta conica da 15 ml. Centrifugare le neurosfere a 250 x g per 5 min.
nota: Le neurosfere possono essere caratterizzate il giorno 12 per i marcatori progenitori neurali, come la nestina e la GFAP.
5. Generazione di cellule simili a cellule di Schwann
- Preparare un terreno di induzione gliale composto da αMEM integrato con β-Heregulin (100 ng/mL), bFGF (10 ng/ml), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-AA, 5 ng/mL), FBS (10%) e P/S (1% v/v).
- Piastra delle neurosfere preparate nella sezione 4 in piastre a 6 pozzetti rivestite di PDL/laminina a una densità di 5-10 sfere per cm2 in 1,5 mL di terreno di induzione gliale per pozzetto. Sostituire il mezzo di induzione gliale ogni 2 giorni dopo il risciacquo delle cellule con PBS.
nota: Si vede che le cellule delle neurosfere seminate migrano verso l'esterno entro il giorno 2. Entro il 7° giorno, le cellule migratorie hanno un aspetto affusolato e dovrebbero dimostrare immunopositività per i marcatori cellulari di Schwann p75 recettore della neurotrofina (p75) e S100β. Queste celle sono indicate come SCLC.
