Generazione di cellule di Schwann impegnate nel destino tramite cocoltura con neuroni DRG
1. Preparazione di neuroni DRG purificati di ratto
- Autoclavare in autoclave tutti gli strumenti di dissezione (ad es. forbici da dissezione, pinze, due pinze per microdissezione e forbici per microdissezione) a 180 °C per almeno 2 ore prima dell'uso.
- Rivestire le piastre per colture tissutali a 6 pozzetti con poli-D-lisina (PDL, 10 μg/mL in PBS) a 4°C per una notte. Rimuovere il PDL e risciacquare con 1,5 m di PBS per pozzetto.
- Procedere con il rivestimento delle piastre con laminina (10 μg/mL in PBS) a 37 °C per 2 ore. Sciacquare le piastre con 1,5 mL di PBS per pozzetto.
- Preparare il terreno di mantenimento dei neuroni DRG, composto da terreno neurobasale integrato con B27 (2% v/v), L-glutammina (1% v/v), fattore di crescita nervoso (NGF, 20 ng/mL) e penicillina/streptomicina (P/S, 1% v/v).
- Preparare il terreno di purificazione dei neuroni DRG, composto da terreno neurobasale integrato con B27 (2% v/v), L-glutammina (1%), fattore di crescita nervoso (NGF, 20 ng/mL), P/S (1%), fluorodesossiuridina (FDU, 10 μg/mL) e uridina (10 μg/mL).
- Sacrificare ratte gravide al giorno gestazionale 14-15 mediante sovradosaggio di pentobarbital (240 mg/kg di peso corporeo, intraperitoneale).
- Posizionare gli animali sacrificati in posizione supina. Pulisci accuratamente l'addome con etanolo al 70%.
- Tagliare longitudinalmente la parete addominale inferiore dell'animale utilizzando forbici da dissezione e pinze. Identificare e rimuovere l'utero utilizzando le forbici da dissezione. Taglia la parete uterina per esporre ed estrarre gli embrioni. Trasferire gli embrioni in una piastra di coltura sterile di 10 cm riempita con PBS. Metti il piatto di coltura sul ghiaccio.
- Trasferire l'embrione destinato alla dissezione in una piastra di coltura sterile di 10 cm riempita con PBS (temperatura ambiente) e posizionarla sotto un microscopio da dissezione. Avere l'embrione in posizione prona.
nota: Il midollo spinale biancastro e i DRG attaccati possono essere visti sopra l'aspetto dorsale dell'embrione, attraverso la sua pelle traslucida.
- Inserire una pinza per microdissezione lungo entrambi i lati del midollo spinale e utilizzare la dissezione smussata per iniziare a separare il midollo spinale dal tessuto molle circostante. Tagliare il midollo spinale dall'animale usando una pinza da microdissezione lungo l'apertura del collo e il troncone della coda. Eseguire un'ulteriore dissezione smussata sull'aspetto ventrale del midollo per liberarlo dai tessuti molli circostanti.
- Utilizzare una pinza da microdissezione per rimuovere i tessuti molli residui sulla faccia dorsale del midollo spinale liberato.
nota: In questa fase, dovrebbero rimanere solo il midollo spinale, le radici nervose e il DRG collegato.
- Staccare i singoli DRG dalle loro radici nervose di collegamento utilizzando una pinza per microdissezione. Utilizzare una penna per pipette collegata a un puntale da 1 ml per trasferire i DRG in una provetta da centrifuga sterile da 1,5 ml contenente PBS.
nota: Per ogni provetta da 1,5 mL possono essere alloggiati un massimo di 100 DRG.
- Centrifugare i DRG a 250 x g per 5 minuti e risospenderli nel reagente di dissociazione cellulare enzimatica ricombinante (200 μl per provetta). Incubare (37 °C, 5% CO2) per 10 min. Centrifugare i DRG a 250 x g per 5 minuti, rimuovere il surnatante e risospendere nel mezzo di mantenimento dei neuroni DRG. Dissociare il pellet mediante triturazione delicata utilizzando un puntale per pipetta da 200 μl. Quantificare le cellule all'interno del pellet utilizzando un emocitometro dopo un'opportuna diluizione.
- Seminare le cellule a una densità di 5.000 cellule/cm2 in piastre a 6 pozzetti rivestite di PDL/laminina in 1,5 mL di terreno di mantenimento dei neuroni DRG per pozzetto. Dopo due giorni di coltura, rimuovere il terreno di mantenimento dei neuroni DRG, risciacquare con PBS e sostituirlo con il mezzo di purificazione dei neuroni DRG.
nota: Per ogni ciclo di purificazione, trattare le colture DRG con terreno di purificazione per 2 giorni, seguiti da 1 giorno di incubazione in terreno di mantenimento. Dopo 3-4 cicli di purificazione, è prevista la rimozione di tutta la glia endogena. Questo dovrebbe richiedere circa 14 giorni. Le colture purificate risultano positive per il marcatore neuronale TUJ1 e sono assenti per l'espressione di S100β (Figura 1).
2. Generazione di cellule simili a cellule di Schwann
- Preparare un terreno di induzione gliale composto da αMEM (Minimum essential medium Eagle (MEM), modificazioni alfa) integrato con β-Heregulin (100 ng/mL), fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF, 10 ng/ml), fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-AA, 5 ng/mL), siero fetale bovino (FBS, 10%) e P/S (1% v/v).
- Piastra le neurosfere preparate nella sezione 4 in piastre a 6 pozzetti rivestite di PDL/laminina a una densità di 5-10 sfere per cm2 in 1,5 mL di terreno di induzione gliale per pozzetto. Sostituire il mezzo di induzione gliale ogni 2 giorni dopo aver risciacquato le cellule con PBS.
- NOTA: Si vede che le cellule delle neurosfere seminate migrano verso l'esterno entro il giorno 2. Entro il 7° giorno, le cellule migratorie hanno un aspetto affusolato e dovrebbero dimostrare immunopositività per i marcatori cellulari di Schwann p75 recettore della neurotrofina (p75) e S100β7. Queste celle sono indicate come SCLC.
3. Cocoltura di SCLC con neuroni DRG
- Preparare il terreno di cocoltura composto da terreno di mantenimento dei neuroni DRG (fase 1.1.4) e terreno di induzione gliale (fase 1.2.1) con un rapporto volume/volume di 1:1.
- Preparare il terreno di mantenimento cellulare Schwann composto dalla miscela F-12 (DMEM/F12) Modified Eagle Medium/Nutrient di Dulbecco, integrata con FBS (5%), β-Heregulin (10 ng/mL) e P/S (1% v/v).
- Rimuovere il terreno di coltura dai SCLC del giorno 7, sciacquarli con PBS e incubarli con 0,5 mL/pozzetto di reagente di dissociazione cellulare enzimatica ricombinante a 37 °C per 5 minuti. Risospendere i SCLC nel terreno di cocoltura.
- Quantificare le cellule utilizzando un emocitometro dopo un'opportuna diluizione.
- Seminare gli SCLC su colture di neuroni DRG purificati a una densità di 1.000 cellule/cm2. Mantenere le cocolture per 14 giorni, con sostituzione media ogni 2 giorni.
nota: Durante la cocoltura, le SCLC hanno acquisito la morfologia fuso-fusolare tipica delle cellule di Schwann mature (Figura 2). Queste cellule persistono nel loro fenotipo dopo il ritiro dei fattori di crescita e sono in grado di mielinare gli assoni in vitro e in vivo. La positività dei marcatori cellulari di Schwann (ad es. p75 e S100β) deve essere monitorata mediante immunofluorescenza.
- Al termine della cocoltura, il passaggio ha impegnato il destino delle cellule di Schwann. Utilizzare 0,5 mL di reagente di dissociazione per pozzetto. Quantificare le cellule utilizzando un emocitometro dopo un'opportuna diluizione.
