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1. Sviluppo delle microcolonne di idrogel di agarosio
- Preparare una soluzione di agarosio al 3% peso/volume (p/v) pesando 3 g di agarosio e trasferendola in un becher sterile contenente 100 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Aggiungere una barra magnetica sterile al becher e posizionarla sulla superficie di una piastra/agitatore riscaldante. Tenere il becher coperto per evitare l'evaporazione del suo contenuto nel passaggio successivo.
- Scaldare l'agarosio e il DPBS a una temperatura di 100 °C e mescolare a 60-120 giri/min. Regolare queste impostazioni in base alle esigenze e monitorare costantemente la progressione del processo di dissoluzione man mano che la soluzione passa inizialmente da opaca a un aspetto chiaro, il che significa che l'agarosio è stato completamente disciolto.
cautela: Il bicchiere caldo e la soluzione sono caldi!
- Mentre la soluzione di agarosio viene riscaldata e mescolata, recuperare quattro piastre di Petri vuote da 10 cm e aggiungere 20 ml di DPBS a due di esse. All'interno della cabina di biosicurezza posizionare gli aghi per agopuntura (diametro: 300 μm, lunghezza: 40 mm), i tubi capillari da microlitro in vetro (diametro: 701,04 μm, lunghezza: 65 mm, capacità: 25,0 μL) e un dispenser a bulbo. Quando la soluzione liquida di agarosio si dichiarisce, mantenere un riscaldamento costante a circa 50 °C e agitare per evitare la gelificazione dell'agarosio.
- Introdurre un ago per agopuntura nell'apertura inferiore di un distributore di bulbi. Inserire un tubo capillare sopra l'ago esposto verso l'esterno. Fissare il tubo capillare inserendo una parte di esso nella sezione in gomma del cilindro dell'erogatore del bulbo.
- Trasferire 1 mL di agarosio liquido con una micropipetta sulla superficie di una capsula di Petri vuota e posizionare un'estremità del tubo capillare verticalmente (con l'ago inserito) a contatto con l'agarosio, mentre il tappo di gomma del dispenser a bulbo viene pizzicato verso l'interno. Rilasciare lentamente la pressione sul tappo dell'erogatore del bulbo per aspirare l'agarosio nel tubo capillare.
nota: Il trasferimento dell'agarosio liquido nei tubi capillari deve essere eseguito rapidamente. Se l'agarosio liquido viene lasciato raffreddare sulla superficie della piastra di Petri per un tempo sufficiente (circa 60 s), inizia a gelificare, impedendo un'adeguata aspirazione dell'agarosio lungo il tubo capillare.
- Posizionare ciascun gruppo bulbo-tubo-ago in una capsula di Petri libera e lasciare solidificare il gel di agarosio all'interno dei tubi capillari per 5 minuti. Estrarre con cautela il tubo capillare con le mani dal tappo di gomma nel cilindro erogatore del bulbo, lasciando l'ago e il gel di agarosio in posizione all'interno del tubo.
- Estrarre manualmente l'ago per agopuntura estraendolo lentamente dal tubo capillare; anche il cilindro di agarosio appena solidificato scivola fuori dal tubo in questa procedura, circondando ancora l'ago. Spingere delicatamente la microcolonna lungo l'ago per agopuntura con la punta di una pinza sterile per spostarla fino alla fine. Posizionare l'ago su una capsula di Petri aperta contenente DPBS e spingere la microcolonna nel DPBS con una pinza.
nota: Se la microcolonna di agarosio rimane all'interno del tubo capillare di vetro dopo la rimozione dell'ago per agopuntura, spingere lentamente la microcolonna di agarosio fuori dal tubo capillare con un ago di calibro 25 mm e nella piastra con DPBS.
- Sterilizzare microbisturi o pinze utilizzando uno sterilizzatore a perline calde. Produrre il 4% p/v di agarosio pesando 4 g di agarosio e trasferendolo in 100 ml di DPBS. Riscaldare e mescolare come spiegato al punto 1.2 per ottenere una soluzione liquida limpida di agarosio al 4%. Mantenere il riscaldamento e l'agitazione della soluzione durante i passaggi seguenti.
- Trasferire le piastre di Petri contenenti le microcolonne in una cappa di dissezione e spostare una microcolonna con una pinza fine in una capsula di Petri vuota. Utilizza lo stereoscopio per la guida visiva e un microbisturi per tagliare le microcolonne alla lunghezza desiderata. Tagliare entrambe le estremità per formare estremità smussate ad angoli di 45o rispetto all'orizzontale per facilitare la manipolazione delle microcolonne durante la matrice extracellulare (ECM) e l'aggiunta di cellule.
- Ripetere il passaggio precedente per altre tre microcolonne nella stessa piastra di Petri e allineare i quattro costrutti in parallelo con una distanza di <3 mm tra ciascuno dei cilindri. Caricare 50 μL di soluzione di agarosio al 4% con una micropipetta e versare una striscia/linea di liquido sull'array di microcolonne per collegare e raggruppare i costrutti in gruppi di quattro (d'ora in poi chiamati "barchette a microcolonna"). Evitare il movimento dell'agarosio al 4% alle estremità delle microcolonne, che potrebbe ostruire l'interno, riducendo al minimo la distanza tra i costrutti e aggiungendo rapidamente l'agarosio in una linea sottile><.
nota: Non è necessario disporre gruppi di quattro microcolonne in "barche" per fabbricare le impalcature astrocitiche. Tuttavia, le barche servono ad accelerare il processo di fabbricazione e ad offrire un modo più sicuro per spostare e movimentare le microcolonne nelle fasi successive.
- Lasciare raffreddare la barca a microcolonna per 1-2 minuti per consentire la gelificazione del 4% di agarosio aggiunto. Sollevare la barchetta a microcolonna con una pinza fine collegando l'agarosio al 4% e spostare le microcolonne nell'altra capsula di Petri contenente DPBS preparata al punto 1.1.3. Fabbricare più barche con le micro-colonne rimanenti come desiderato.
- Spostare le piastre di Petri contenenti le microcolonne e/o le barchette in una cabina di biosicurezza e sterilizzarle con esposizione alla luce ultravioletta (UV) per 30 min.
cautela: Indossare una protezione adeguata per prevenire l'esposizione ai raggi UV.
- Conservare le piastre con le barchette a microcolonna in DPBS a 4 °C, se l'aggiunta di ECM e la placcatura delle celle non avverranno subito dopo, fino a 1 settimana. Ripetere i passaggi di fabbricazione delle microcolonne se i costrutti non vengono utilizzati durante questo intervallo di tempo.
2. Coltura cellulare primaria e isolamento
- Isolamento corticale degli astrociti da cuccioli di ratto
- In preparazione per i passaggi successivi, aggiungere 20 ml di soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) a quattro piastre di Petri da 10 cm che fungeranno da serbatoi per i tessuti sezionati. Tenete tutti i piatti in ghiaccio. Sterilizzare forbici chirurgiche pulite, pinze, microspatole e microbisturi in uno sterilizzatore a perline caldo.
- Preriscaldare lo 0,25% di tripsina con 1 mM di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e 0,15 mg/mL di desossiribonucleasi (DNasi) I in HBSS a 37 °C. Inoltre, preriscaldare il terreno di coltura degli astrociti a 37 °C, che consiste nel Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco con la miscela di nutrienti F-12 di Ham e il 10% di siero fetale bovino (FBS).
- Anestetizzare i cuccioli di ratto Sprague-Dawley postnatale del giorno 0 o del giorno 1 esponendoli a condizioni di ipotermia e sopprimerli per decapitazione. Fissare la testa in un tavolino utilizzando un ago di calibro 19 mm posizionato nel muso anteriormente agli occhi.
- Fai un'incisione con un bisturi lungo il centro posteriore fino ad anteriormente, dalla base del collo fino a dietro gli occhi. Eseguire un'altra incisione andando lateralmente direttamente da dietro gli occhi verso il basso, formando una forma a T. Usa una pinza fine per tirare di lato la pelle cranica/cranio.
- Tenere la testa per il muso (rivolta verso l'alto) posizionando un polo della pinza nella bocca dell'animale e l'altro sulla superficie esterna. Rimuovere il cervello con una micro-spatola sterile e metterlo in una delle piastre di Petri riempite con HBSS freddo. Mettere questa capsula di Petri sul ghiaccio subito dopo e in ogni momento tranne quando è in uso.
- Posizionare un blocco di granito precedentemente conservato a -20 °C al di sotto di uno stereoscopio all'interno di una cappa di dissezione. Posizionare la capsula di Petri con il tessuto cerebrale sulla superficie del blocco di granito per preservarne la bassa temperatura durante la procedura di dissezione. Usa lo stereoscopio come guida visiva nei passaggi seguenti.
- Se i bulbi olfattivi rimangono intatti, estrarli tagliandoli con una pinza o un microbisturi. Inoltre, utilizzare un microbisturi per rimuovere il cervelletto e per praticare un'incisione sulla linea mediana che separa i due emisferi cerebrali. Trasferire gli emisferi con una pinza in una capsula di Petri contenente HBSS fresco e refrigerato.
- Sezionare le strutture del mesencefalo dall'interno degli emisferi con un microbisturi per ottenere solo le cortecce separate. Utilizzare una pinza fine per staccare le meningi, una struttura simile a un foglio, dal tessuto corticale e per trasferire le cortecce isolate in una nuova piastra di Petri con HBSS freddo. Utilizzare il microbisturi per tritare il tessuto al fine di aumentare la superficie per l'azione della tripsina nel passaggio successivo.
- Utilizzare una pipetta Pasteur per trasferire le cortecce in una provetta da centrifuga da 15 ml contenente 4 ml di tripsina-EDTA preriscaldata (8 cortecce in ciascuna provetta). Esporre il tessuto corticale alla tripsina-EDTA per 5-7 minuti a 37 °C.
- Con una pipetta Pasteur, rimuovere con cautela la tripsina-EDTA e aggiungere 400 μl di soluzione di DNAsi I 0,15 mg/mL alla provetta da centrifuga. Agitare il tubo o il vortice fino a quando tutto il tessuto è dissociato e non ci sono pezzi di tessuto rimanenti nel liquido. Se non è possibile sciogliere completamente il fazzoletto, rimuovere i frammenti rimanenti con la punta di una pipetta Pasteur.
- Centrifugare la provetta contenente la soluzione cellulare dissociata a 200 x g per 3 minuti. Rimuovere il surnatante con una pipetta Pasteur senza disturbare le cellule. Aggiungere 1 mL di terreno di coltura per astrociti (definito al punto 2.1.2) alla provetta con una micropipetta e agitare per risospendere e creare una soluzione omogenea.
- Trasferire 10 mL di terreno di coltura per astrociti con una pipetta sierologica in un pallone T-75. Aggiungere 250 μl della soluzione cellulare da 1 mL (preparata al punto 2.1.11) con una micropipetta al pallone per preparare un cervello di cucciolo di cellule per pallone. Distribuire uniformemente la soluzione cellulare scaricata sul terreno di coltura e agitare delicatamente il pallone per favorire ulteriormente una distribuzione uniforme.
- Coltivare i palloni placcati in un incubatore umidificato a 37 °C e 5% di CO2. Dopo aver raggiunto le 24 e le 72 ore in coltura, agitare meccanicamente il pallone per staccare i tipi di cellule non aderenti, come neuroni e oligodendrociti.
- Successivamente, in ciascuno di questi punti temporali, eseguire un cambio di supporto. Tenere il pallone verticalmente in modo che il terreno di coltura si trovi sul fondo del pallone, senza coprire le cellule aderenti. Aspirare il terreno di coltura con una pipetta Pasteur, premendo la punta della pipetta contro l'angolo inferiore del pallone per evitare di estrarre le cellule. Posizionare il matraccio nella posizione orizzontale originale e aggiungere delicatamente 10 mL di terreno per astrociti sulle cellule con una pipetta sierologica.
- Rimettere i palloni nell'incubatrice dopo ogni cambio di fluido. Dopo aver raggiunto la confluenza del 90%, agitare nuovamente meccanicamente il pallone per rimuovere le cellule non aderenti rimanenti.
- Far passare gli astrociti estraendo il terreno di coltura con un vuoto e una pipetta Pasteur. Aggiungere 5 mL di tripsina-EDTA allo 0,25% con una pipetta sierologica sulle cellule aderenti. Agitare delicatamente il matraccio per assicurarsi che la tripsina copra tutte le cellule e incubare il pallone per 5-7 minuti a 37 °C e 5% di CO2.
- Estinguere la tripsina aggiungendo 1 mL di terreno astrocitario alle cellule con una pipetta sierologica. Estrarre la soluzione cellulare dal matraccio con una pipetta sierologica e trasferirla in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Centrifugare la provetta a 200 x g per 3 min.
- Rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica e risospenderlo in 1 mL di terreno di coltura per astrociti. Agitare il tubo per assicurarsi che la soluzione cellulare sia omogenea. Contare il numero di cellule nella soluzione con un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
nota: Una fiaschetta confluente al 90% produce in genere circa 3 milioni di astrociti.
- Aggiungere 10 mL di terreno di coltura per astrociti in un pallone T-75. Eseguire una diluizione 1:4 trasferendo 250 μl della soluzione cellulare (passaggio 2.1.18) con una micropipetta nel pallone T-75 che contiene già terreno di coltura. Agitare delicatamente per garantire una distribuzione omogenea delle cellule su tutta la superficie del pallone.
- Ripetere i passaggi 2.1.16-2.1.19 ogni volta che si raggiunge il 90% di confluenza per far passare le cellule.
- Isolamento dei neuroni corticali dai feti di ratto
- Seguire preparazioni simili ai passaggi 2.1.1 e 2.1.2, con l'eccezione che il terreno preriscaldato è un terreno di co-coltura, costituito da terreno neurobasale + 2% di integratore di B-27 (per i neuroni) + 1% di integratore G-5 senza siero (per gli astrociti) + 0,25% di L-glutammina.
- Eutanasia temporizzata incinta embrionale giorno 18 ratti Sprague-Dawley con asfissia da anidride carbonica e confermare la morte per decapitazione.
- Estrarre i feti di ratto e sezionare le cortecce dal resto del tessuto cerebrale in piastre di Petri contenenti HBSS sulla superficie del blocco di granito raffreddato, utilizzando uno stereoscopio per la guida visiva e forbici, microbisturi e pinze sterilizzati. Dopo la successiva dissezione delle teste, del cervello, degli emisferi cerebrali e delle cortecce cortice, trasferire ogni tessuto in una nuova capsula di Petri riempita di HBSS.
- Tritare il tessuto corticale in frammenti più piccoli per aumentare la superficie della tripsina. Trasferire 4-6 cortecce con una pipetta Pasteur in una provetta con 5 mL di tripsina-EDTA preriscaldata e mantenere a 37 °C per dissociare il tessuto. A 5-7 minuti agitare manualmente la provetta per mescolare e prevenire la formazione di grumi del tessuto.
- Togliere il tubo da 37 °C dopo 10 minuti. Come spiegato in precedenza al punto 2.1, estrarre la tripsina-EDTA e sostituirla con 1,8 mL di soluzione di DNAsi 0,15 mg/mL. Successivamente, agitare il tessuto fino a quando la soluzione appare omogenea, senza frammenti di tessuto che galleggiano nel liquido.
- Centrifugare la soluzione tissutale dissociata a 200 x g per 3 minuti. Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere in 2 mL di terreno di co-coltura. Contare il numero di cellule in questa soluzione con un emocitometro o un contatore automatico di cellule.
nota: La resa abituale è di 3,0-5,0 x 106 cellule/emisfero corticale.
- Preparare una nuova soluzione cellulare con una densità di 2,0-4,0 x 105 cellule/mL nei terreni di co-coltura definiti sopra.
3. Sviluppo dei cavi astrocitici all'interno delle micro-colonne
- Fabbricazione di anime ECM
NOTA: L'ECM deve essere aggiunto all'interno delle microcolonne di idrogel lo stesso giorno in cui verrà eseguita la semina cellulare.
- All'interno di una cappa di biosicurezza, preparare una soluzione da 1 mg/mL di collagene di coda di ratto di tipo I in terreno di co-coltura in una provetta sterile per microcentrifuga. Mantenere sempre la provetta per microcentrifuga con la soluzione ECM sul ghiaccio, tranne quando è in uso.
- Trasferire 1-2 μL della soluzione ECM con una micropipetta su una striscia di cartina di tornasole per stimarne il pH. Aggiungere 1 μl di idrossido di sodio (NaOH) o acido cloridrico (HCl) 1 N con una micropipetta per aumentare o diminuire il pH della soluzione ECM, rispettivamente, e pipettare su e giù per omogeneizzare. Verificare il nuovo pH con una striscia di cartina di tornasole e aggiungere altro acido o base, se necessario, fino a quando il pH non è stabile nell'intervallo 7,2-7,4.
- Spostare le piastre di Petri dal passaggio 1.2 a una cappa di dissezione e trasferire 4-5 microcolonne o una barca con pinze fini sterili in una piastra di Petri vuota e sterile da 35 o 60 mm. Utilizzando lo stereoscopio come guida, posizionare la punta da 10 μl di una micropipetta a un'estremità di ciascuna microcolonna e aspirare per svuotare il lume del DPBS e delle bolle d'aria. Confermare l'assenza di bolle d'aria con lo stereoscopio per assicurarsi che l'ECM aggiunta nel passaggio successivo possa fluire liberamente attraverso il lume.
- Caricare una micropipetta P10 con una soluzione ECM, posizionare la punta da 10 μl contro un'estremità delle microcolonne in idrogel ed erogare una soluzione sufficiente a riempire il lume (circa 3-5 μl), osservando l'ingresso della ECM con lo stereoscopio. Pipettare un piccolo serbatoio (2-4 μL) di soluzione ECM su entrambe le estremità della microcolonna.
nota: Gestire sempre 4-5 microcolonne o una barca alla volta per evitare l'essiccazione prolungata dei costrutti, in quanto ciò potrebbe comportare l'accartocciamento della struttura della microcolonna. Le microcolonne completamente essiccate si attaccano saldamente alla superficie delle piastre di Petri, impedendone l'utilizzo per la semina cellulare. Quantità eccessive di terreni di co-coltura (come misura di idratazione) non possono essere aggiunte alle microcolonne perché ciò potrebbe causare la fuoriuscita della MEC durante il periodo di incubazione descritto di seguito.
- Pipettare i terreni di co-coltura in un anello attorno alla capsula di Petri per fornire un pozzo di umidità per evitare che le colonne si secchino durante l'incubazione. Incubare la capsula di Petri contenente le microcolonne contenenti ECM a 37 °C e CO2 al 5% per 1 ora per promuovere la polimerizzazione del collagene prima di aggiungere i neuroni e/o gli astrociti.
nota: L'ECM dovrebbe formare uno strato che ricopre la superficie interna del lume cavo, piuttosto che un nucleo solido dell'ECM che abbraccia l'interno, entrambi i quali possono essere osservati utilizzando lo stereoscopio. Se l'ECM forma un nucleo, continuare il periodo di incubazione fino a quando non rimane solo lo strato. Con questo strato formato, la soluzione di cellule astrocitarie può riempire l'interno della microcolonna nelle fasi di placcatura.
- Durante il periodo di incubazione, preparare la soluzione di cellule astrocitarie (come descritto di seguito).
- Semina di astrociti e neuroni nelle micro-colonne
- Passaggio degli astrociti placcati (tra il quarto e il dodicesimo passaggio) come spiegato nei passaggi 2.1.16-2.1.19. Dopo aver contato il numero di cellule nel pallone, preparare la soluzione cellulare a una densità di 9,0-12,0 x 105 cellule/mL di soluzione sospesa in terreni di coltura cellulare.
- Utilizzando uno stereoscopio, posizionare la punta di una micropipetta P10 a un'estremità delle microcolonne e trasferire una quantità sufficiente di soluzione cellulare (~5 μL) nel lume per riempirla completamente. Come fatto sopra con l'ECM, aggiungere piccoli serbatoi di soluzione cellulare a entrambe le estremità di ciascuna microcolonna.
- Incubare le microcolonne piastrate sulle piastre di Petri a 37 °C e CO2 al 5% per 1 ora per favorire l'adesione degli astrociti alla MEC. Se i neuroni non verranno aggiunti alle microcolonne, procedere al passaggio 3.2.5.
- Dopo il periodo di incubazione iniziale, aggiungere 1-2 μL della soluzione di neurone corticale ottenuta al punto 2.2.7 in entrambe le estremità delle microcolonne con una micropipetta, osservando sotto lo stereoscopio. Assicurarsi che nelle piastre sia presente una quantità sufficiente di terreno per evitare l'essiccazione e incubare nuovamente per 40 minuti a 37 °C e 5% di CO2 per consentire l'adesione dei neuroni.
nota: La soluzione di neurone corticale può anche essere aggiunta 1-2 giorni dopo la formazione del fascio, eseguendo il passaggio 3.2.4 dopo aver rimosso accuratamente il terreno di coltura dalla piastra di Petri con una micropipetta.
- Dopo il periodo di incubazione, riempire accuratamente le piastre di Petri contenenti le microcolonne piastrate con 3 o 6 mL di terreno di co-coltura per piastre di Petri da 35 o 60 mm, rispettivamente. Mantenere le microcolonne piastrate in coltura a 37 °C e 5% di CO2 per favorire l'autoassemblaggio dei fasci astrocitici allineati, che dovrebbero formare una struttura a fascio simile a un cavo dopo 6-10 ore.