Sviluppo di un modello 3D ingegnerizzato basato su seta-collagene di tessuto neurale polarizzato

Abstract

Fonte: Chwalek, K. et al., Modello ingegnerizzato basato su seta-collagene di tessuto neurale polarizzato. J. Vis. Exp. (2015).

Questo video mostra la creazione di un modello di tessuto neurale polarizzato in 3D utilizzando scaffold di seta-collagene. Descrive in dettaglio il processo di semina delle cellule neuronali su scaffold di seta porosa, l'incubazione per l'attaccamento cellulare, l'incorporazione dell'impalcatura con il collagene e sottolinea l'importanza della matrice di collagene di supporto nella formazione di un modello di tessuto neurale polarizzato 3D.

Protocol

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparazione dell'impalcatura in seta

1. Preparazione della soluzione di seta dai bozzoli di Bombyx mori
   1. Taglia ogni bozzolo in 8 pezzi uguali usando le forbici. Utilizzare circa 11 bozzoli per 5 g di bozzoli frammentati. (15 minuti)
   2. Preparare 2 L di soluzione 0,02 M Na₂CO₃ e far bollire con una piastra calda. (15 minuti)
   3. Pesare 5 g di bozzoli frammentati e farli bollire in soluzione di Na₂CO₃ per 30 min. Mescolare la seta bollente ogni due minuti con una spatola. Questo passaggio, chiamato sgommatura, purifica la fibroina della seta dalle proteine idrofile, le sericine. (30 minuti)
   4. Strizzare la fibroina a mano e sciacquarla in acqua distillata almeno tre volte per lavare via eventuali residui di sericina e sostanze chimiche. (5 minuti)
   5. Posizionare la fibroina umida su una capsula di Petri e asciugare l'estratto di fibroina nella cappa di flusso O/N.
   6. Il giorno successivo, pesare la massa secca di fibroina e metterla in un becher di vetro. (15 minuti)
   7. Per sciogliere la fibroina in una soluzione di LiBr 9,3 M, calcolare il volume richiesto (in ml) di LiBr moltiplicando la massa di fibroina secca per 4. Versare lentamente la soluzione di LiBr sulla fibroina di seta e utilizzare una spatola per immergere tutte le fibre di fibroina. Coprire il becher per evitare l'evaporazione e posizionarlo a 60 °C per 4 ore per consentire alle fibre di sciogliersi. (15 minuti)
   8. Utilizzando la siringa, raccogliere la soluzione di fibroina dal becher e caricarla nelle cassette per dialisi MWCO 3.500. Eseguire la dialisi contro acqua distillata per 48 ore. Cambia l'acqua ogni due ore.
   9. Utilizzando la siringa, raccogliere la soluzione di fibroina dalle cassette in provette coniche da 50 ml e centrifugare due volte a 9.000 giri/min (~12.700 x g) a 4 °C per 20 minuti. Dopo ogni fase di centrifugazione, versare il surnatante in una provetta nuova e gettare il pellet. (40 minuti)
   10. Misurare la concentrazione della fibroina stimando il peso secco. Versare 1 ml di soluzione di seta in una bilancia. Asciugare il campione in forno a 60 °C per 2 ore. Pesare la fibroina di seta secca e calcolare la concentrazione di soluzione di fibroina di seta moltiplicando il peso ottenuto per 100. La concentrazione prevista della soluzione di seta è del 6-9% (p/v).
   11. Regolare la concentrazione di seta al 6% (p/v) diluendola in acqua distillata.
       Punto di arresto: la fibroina di seta liquida può essere conservata a 4 °C per un massimo di un mese in un contenitore chiuso.
2. Preparazione di scaffold porosi da soluzione di seta.
   1. Setacciare il NaCl granulare per separare i granuli da 500-600 μm, che verranno utilizzati nelle fasi successive. Scartare i granuli di dimensioni inferiori a 500 μm e superiori a 600 μm (15 min)
   2. Versare 30 ml di soluzione di seta al 6% nello stampo in politetrafluoroetilene (PTFE) (Figura 1). Versare delicatamente 60 g di NaCl setacciato sulla seta. Picchiettare il contenitore per ottenere uno strato uniforme di sale. Incubare 48 ore a RT per polimerizzare la seta.
   3. Posizionare lo stampo in PTFE contenente scaffold in forno a 60 °C per 1 ora per finalizzare la polimerizzazione ed evaporare il liquido residuo.
   4. Mettere il contenuto dello stampo in PTFE in un becher contenente 2 L di acqua distillata per 48 ore per lisciviare il sale. Cambiare l'acqua 2-3 volte al giorno. Rimuovere le impalcature di spugna dagli stampi quando il sale è completamente lisciviato.
      Punto di sosta: Le spugne possono essere conservate immerse in acqua a 4 °C in un contenitore chiuso per evitare che i ponteggi si disidratino.
   5. Ritagliare le impalcature con un punzone per biopsia di 5 mm di diametro quando sono pronte. Pretagliare i ponteggi in modo che raggiungano circa 2 mm di altezza. Perforare il centro dell'impalcatura con il punzone per biopsia da 2 mm di diametro (Figura 2A). (1 ora)
   6. Autoclavare i ponteggi immersi in acqua per sterilizzarli (ciclo umido, 121 °C, 20 min).
      Punto di sosta: Le spugne possono essere conservate immerse in acqua a 4 °C in un contenitore chiuso per evitare che i ponteggi si disidratino.
   7. Prima della semina cellulare pianificata, immergere gli scaffold in una soluzione sterile di poli-D-lisina (PDL) 0,1 mg/ml. Incubare per 1 ora a 37 °C.
   8. Lavare gli scaffold 3 volte con soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per rimuovere la PDL non legata. (30 minuti)

2. Isolamento dei neuroni corticali di ratto

1. Sezionare le cortecce dai ratti Sprague-Dawley embrionali del giorno 18 (E18) dopo aver ottenuto il protocollo animale approvato. (2 ore)
2. Incubare 10 cortecce in 5 ml di tripsina allo 0,25% con DNasi I allo 0,3% (da pancreas bovino) per 20 minuti a 37 °C.
3. Inattivare la tripsina aggiungendo 1 mg/ml di proteina di soia.
4. Triturare le cortecce utilizzando una pipetta Pasteur da 10 ml pipettando su e giù 20 volte fino a generare una singola sospensione cellulare. Sii delicato ed evita la formazione di bolle d'aria. (10 minuti)
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 127 x g per 5 minuti.
6. Risospendere il pellet cellulare in 10 ml di terreno di coltura (terreno neurobasale, 1x integratore di B27, 1x Glutamax, 1% penicillina/streptomicina). Conta le celle. La concentrazione cellulare attesa è di circa 2x10⁷/ml. (20 min)

3. Costruisci Assemblea e Cultura

1. Semina su scaffold con cellule
   1. Spostare gli scaffold sterili e tutti gli utensili necessari all'interno di una cappa per colture cellulari. Posizionare gli scaffold in una piastra di coltura cellulare a 96 pozzetti utilizzando una pinza sterile, assegnando uno scaffold per pozzetto. (10 minuti)
   2. Immergere gli scaffold nel terreno di coltura cellulare per equilibrarli prima della semina cellulare. Incubare per 1 ora a 37 °C. (10 min)
   3. Aspirare l'eccesso di fluido dalle impalcature.
   4. Applicare 100 μl di sospensione/scaffold cellulare. (10 minuti)
   5. Incubare le cellule a 37 °C O/N per consentire l'adesione delle cellule all'impalcatura.
   6. La mattina seguente, aspirare le cellule non attaccate e applicare 200 μl/pozzetto di terreno di coltura fresco. (10 minuti)
2. Inclusione di scaffold con matrice di collagene. (2 ore)
   1. Mettere 10x PBS, acqua, 1 N NaOH e collagene di coda di ratto I sul ghiaccio. Preparare una soluzione funzionante di collagene secondo le istruzioni del produttore. Mantenere in ghiaccio fino a quando i costrutti seminati nelle cellule non sono pronti (fino a 1 ora).
   2. Rimuovere i costrutti di seta con semi cellulari dall'incubatore e aspirare il terreno in eccesso.
   3. Trasferire gli scaffold nei pozzetti vuoti sulla piastra a pozzetti utilizzando una pinza sterile e immergere ogni scaffold in 100 μl di soluzione di collagene 3 mg/ml. Riposizionare la piastra di coltura tissutale nell'incubatore per 30 minuti per consentire la polimerizzazione del collagene.
   4. Applicare 100 μl di terreno/pozzetto di coltura cellulare preriscaldato. Coltiva i costrutti per una settimana, cambiando il mezzo ogni giorno sostituendo solo metà del volume del mezzo.

Results

Figura 1. Stampo in PTFE utilizzato per la preparazione di impalcature in spugna di seta. Le dimensioni: 10 cm di diametro, 2 cm di altezza.

Figura 2. Modello 3D di tessuto simile al cervello. (A) Impalcatura porosa in spugna di seta. (B)

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Centrifuga 5804 R	Eppendorf
poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	P6407-5MG	concentrazione finale 10 μg/ml, disciolto in acqua
Terreno neurobasale	Gibco	21103049	riscaldare fino a 37 °C prima dell'uso
Supplemento B27 50x	Gibco	17504-044
Glutamax	Gibco	35050-061
Penicilina Streptomicina	Corning	30-002-CI
Collagene I, coda di ratto, 100 mg	Corning	354236	concentrazione finale 3 mg/ml
NaOH	Sigma-Aldrich	S2770	corrosivo
PBS	Sigma-Aldrich	D1283-500ML
Na2CO3	Sigma-Aldrich	223530
LiBr	Sigma-Aldrich	213225
Cassette per dialisi MWCO 3500	Thermo Fisher	66110
Piastra riscaldante	Fisher Scientific	Isotemp
Setacciamento	Fisher Scientific	n. 270, n. 35, n. 30
PTFE			stampo fatto in casa (Figura 1) 10 cm di diametro, 2 cm di altezza
NaCl	Sigma-Aldrich	71382
Punzone per biopsia 5 mm	Strumento di precisione mondiale	501909
Punzone per biopsia 2 mm	Strumento di precisione mondiale	501908
tripsina	Sigma-Aldrich	T4049-500ML
DNase	Roche	10104159001	concentrazione finale 0,3%
Proteine della soia	Sigma-Aldrich	T6522-100MG	concentrazione finale 1 mg/ml