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1. Periodo di differenziazione prima della riplaccatura
- Differenziare i neuroni su piatti di 10 cm, utilizzando un protocollo a scelta, fino a quando i neuroni non hanno formato una fitta rete con i loro processi ed esprimono non solo marcatori neuronali precoci come MAP2 o TuJ1, ma anche marcatori tardivi come NeuN.
- Cambiare metà del mezzo di scelta ogni 4 giorni durante il processo di differenziazione neuronale.
nota: Cambiamenti del mezzo più estesi o frequenti diluiscono i fattori trofici essenziali e potrebbero sfavorire la maturazione.
- Per i neuroni WT126 derivati da iPSC, utilizzare i seguenti terreni di coltura post-differenziazione: 5 mL di integratore 100x N2 (neurale), 10 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF), 10 ng/mL di fattore neurotrofico derivato da linee cellulari gliali (GDNF), 1 μg/mL di laminina, 200 μM di acido ascorbico, 1 μM di dibutirril-cAMP e 10 mL di SM1 per 500 mL di Dulbecco di miscela modificata di Eagle's medium/nutriente F-12 (DMEM/F12). Gradualmente, utilizzando le modifiche a metà del terreno, sostituire con il mezzo basale neurale (Tabella dei materiali) e gli stessi integratori.
- Per le cellule staminali pluripotenti indotte o i neuroni CVB WT derivati da iPSC, utilizzare il seguente terreno di coltura post-differenziazione: 500 mL di terreno neurale basale A (Tabella dei materiali) e 500 mL di terreno DMEM/F12 con 2 μg/mL di laminina, 10 mL di integratore di glutammina (Tabella dei materiali), 0,75 mg/mL di bicarbonato di sodio, 5 mL di terreno essenziale minimo (MEM) di amminoacidi non essenziali, 0,2 mM di acido ascorbico, 10 ng/mL di BDNF, 20 mL di 50x B27 e 10 mL di integratore di 100x N2.
2. Rivestimento di pozzetti multipli
- Il giorno prima della riplaccatura, rivestire con poli-L-ornitina (PLO). Sciogliere l'OLP in acqua sterile per ottenere una soluzione madre (10 mg/mL). Conservare questo stock a -20 °C. Diluire PLO 1:100 in acqua per ottenere una concentrazione di 50 μg/mL quando si riveste il vetro e un rapporto 1:1.000 (10 μg/mL) quando si riveste la plastica.
- Applicare il rivestimento direttamente sulle piastre target. Utilizzare il volume di rivestimento appropriato alle dimensioni della piastra (ad esempio, per una piastra a 24 pozzetti, applicare 500 μl di soluzione di PLO per pozzetto).
- Lasciare riposare i piatti al buio per una notte a temperatura ambiente.
- Recuperare le piastre rivestite il giorno della riplaccatura e trasferirle in una cappa di biosicurezza sterile.
- Aspirare la soluzione di OLP e risciacquare due volte con acqua sterile.
- Diluire la laminina (1,15 mg/mL) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) alla diluizione 1:400.
nota: Scongelare la laminina a 4 °C e aggiungerla rapidamente al PBS per evitare l'aggregazione della laminina e il rivestimento irregolare.
- Aspirare acqua sterile e applicare 500 μL di rivestimento di laminina su pozzetti precedentemente rivestiti con PLO.
- Mettere le piastre in un'incubatrice a 37 °C per un minimo di 4-6 ore. Utilizzare incubazioni più lunghe, fino a 16 ore, per le superfici in vetro. Utilizzare tempi di incubazione costanti.
3. Riplaccatura di neuroni differenziati
- Sciacquare delicatamente la piastra di neuroni differenziati con PBS una volta. Disperdere delicatamente il PBS lungo la parete della piastra e non direttamente sulle cellule, per evitare di interromperle.
- Aspirare delicatamente il PBS, facendo attenzione a non toccare direttamente le cellule ma ad aspirare dal bordo del piatto mentre lo si inclina verso il ricercatore.
- Applicare un minimo di 1 mL di enzima proteolitico (Tabella dei materiali) per piastra da 10 cm e rimettere le cellule nell'incubatore. Aggiungere volumi leggermente più elevati se la sala di coltura dei tessuti mostra un alto tasso di evaporazione a causa della bassa umidità.
- Incubare le cellule con l'enzima proteolitico per 40-45 minuti in modo da staccarle dalla piastra e staccarle da altri neuroni all'interno della rete neuronale.
nota: Il tempismo in questa fase è fondamentale. L'estinzione della proteasi troppo precoce può portare a un aumento della morte cellulare dopo la riplaccatura. Il produttore dell'enzima proteolitico raccomanda di utilizzare temperature molto inferiori a 37 °C con periodi di incubazione più lunghi per il passaggio di linee cellulari (ad esempio, durante la notte a 4 °C). Tuttavia, la manipolazione dei neuroni a 4 °C dovrebbe essere evitata, poiché spesso mostrano una scarsa sopravvivenza dopo l'esposizione al freddo. Il produttore afferma inoltre che un'incubazione di 60 minuti con l'enzima a 37 °C porta alla sua inattivazione enzimatica. Tuttavia, nell'esperienza degli autori, un'incubazione di 40-45 minuti di colture neuronali derivate da hiPSC a 37 °C è sufficiente per una dissociazione efficiente e un'eccellente sopravvivenza neuronale dopo il replating.
- Controllare i neuroni su un microscopio a contrasto di fase durante il periodo di incubazione e lasciare che il trattamento con proteasi continui fino a quando la rete neurale non si stacca completamente dalla piastra e inizia a rompersi in fogli più piccoli dopo aver agitato brevemente la piastra al microscopio.
- Spegnere l'attività della proteasi utilizzando 5 mL di terreno DMEM fresco per 1 mL di proteasi nella piastra da 10 cm per fermare la digestione. Triturare delicatamente le cellule contro la piastra 5-8 volte per interrompere la rete, utilizzando pipette sierologiche. Fai attenzione a non applicare troppa pressione durante la triturazione, poiché i neuroni differenziati sono fragili. Non utilizzare una punta P1000, poiché l'estremità è troppo affilata e stretta e quindi può sporgere o danneggiare i neuroni.
- Applicare la soluzione con le cellule attraverso un colino cellulare con rete di 100 μm di diametro in una provetta conica fresca da 50 mL goccia a goccia.
- Sciacquare il colino con altri 5 ml di terreno DMEM fresco, dopo che le cellule sono filtrate.
- Centrifugare le celle in una centrifuga da banco a 1.000 x g per 5 min.
- Rimettere la provetta conica nella cabina di biosicurezza e aspirare la maggior parte del terreno, lasciando circa 250 μl per garantire che le cellule trattengano l'umidità.
- Risospendere delicatamente le cellule in 2 mL di terreno DMEM fresco. Non pipettare il pellet contro il lato del tubo. Invece, capovolgere delicatamente la provetta conica 2-3 volte e far passare le cellule attraverso l'estremità di una pipetta sierologica da 5 ml per rimuoverle.
- Applicare 10 μL di neuroni risospesi sul bordo di un emocitometro.
- Aggiungere 8-10 μL di blu di tripano alla gocciolina di cellule per valutare la vitalità cellulare durante questa fase di risospensione. Applicare 10 μl di questa miscela all'emocitometro o ad altri contatori cellulari automatici. Valutare come vitali quelle cellule che sono in fase brillante ed escludere il colorante blu di tripano.
- Determinare la quantità di cellule vitali/mL e prepararsi a diluire il contenuto della provetta conica in base alla densità cellulare desiderata.
- Piastra ~10.000 celle per pozzetto per una piastra da 384 pozzetti; piastra ~150.000-200.000 celle per pozzetto per una piastra da 24 pozzetti.
- Aggiungere DMEM fresco al tubo conico delle cellule risospese per ottenere una diluizione appropriata e aggiungere ulteriori integratori appropriati come B27 e/o BDNF, a seconda delle esigenze della specifica linea cellulare.
- Inclinare delicatamente il tubo conico per mescolare 2-3 volte.
- Aspirare il rivestimento di laminina dalla piastra a 24 pozzetti o dalla piastra multipozzetto a 384 pozzetti utilizzando una pipetta a 16 canali e risciacquare una volta con PBS.
- Aspirare il PBS utilizzando un P1000 per la piastra a 24 pozzetti o la pipetta a 16 canali per piastre a 384 pozzetti.
- Applicare la soluzione cellulare su ciascun pozzetto con un movimento a forma di otto per evitare la formazione di grumi. L'uniformità della placcatura potrebbe anche essere ottimizzata utilizzando dispositivi automatizzati per la manipolazione dei liquidi.
nota: L'aggiunta di laminina al terreno a partire da 2-4 giorni dopo la riplaccatura aiuta anche a mantenere una distribuzione omogenea delle cellule.
- Ripetere i passaggi 3.19 e 3.20 per ogni pozzetto.
- Rimettere la piastra nell'incubatore, impostata a 37 °C e 5% di anidride carbonica.
- Dopo 2 giorni, iniziare a cambiare metà del terreno ogni 4 giorni utilizzando il terreno di coltura post-differenziazione descritto nel paragrafo 1.2.