$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Fabbricazione di stampi SU-8 mediante fotolitografia
NOTA: Questa procedura coinvolge sostanze chimiche pericolose. Utilizzare cappa aspirante e DPI dappertutto.
- Pulire il wafer di silicio (4 pollici di diametro, 1 mm di spessore, lucidato) con acetone e soffiare con azoto gassoso. Infornate quindi a 180 °C per 3 minuti ad asciugare.
- Erogare 3 mL di SU-8 2100 su un wafer pulito.
- Rivestire uniformemente l'SU-8 sul wafer utilizzando una centrifuga a 500 giri/min per 10 s e poi, centrifugare in sequenza a 1500 giri/min per 30 s con un'accelerazione di 300 giri/min per ottenere uno strato spesso 150 μm di SU-8.
NOTA: Assicurarsi che il wafer di silicone sia posizionato al centro della centrifuga e fissato correttamente dal vuoto.
- Cuocere la cialda sulla piastra calda a 50 °C per 10 min, a 65 °C per 7 min e a 95 °C per 45 min.
- Posizionare la fotomaschera (Figura 1) sull'allineatore della maschera ed esporre la luce UV (365 nm) per 60 s.
NOTA: Il tempo di esposizione deve essere ottimizzato da una dose appropriata di luce UV.
- Dopo l'esposizione, cuocere la cialda a 65 °C per 6 minuti e a 95 °C per 13 minuti sulla piastra calda.
- Sviluppare il wafer per 10-20 minuti nello sviluppatore SU-8 con agitazione utilizzando un agitatore orbitale, cambiando la soluzione di sviluppo una volta durante il processo><.
NOTA: Prolungare il tempo di sviluppo quando rimangono i detriti dell'SU-8.
- Sciacquare il wafer in isopropanolo e asciugare delicatamente il wafer con azoto gassoso.
- Misurare l'altezza dell'SU-8 depositato con un microscopio di misura e assicurarsi che abbia uno spessore di circa 150 μm. Può essere conservato a tempo indeterminato a temperatura ambiente.
2. Fabbricazione di chip per colture tissutali basate su microfluidica a base di polidimetilsilossano (PDMS)
- Fissare il wafer depositato con SU-8 a un contenitore (ad es. una piastra di Petri di plastica da 15 cm) con del nastro biadesivo.
- Soffiare via la polvere dal wafer usando azoto gassoso.
- Per silanizzare, mettere il wafer depositato con SU-8 in una camera a vuoto insieme a un piccolo contenitore (ad es. piatto da 35 mm). Far cadere 10 μL di (tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil)-1-triclorosilano nel piccolo contenitore. Non applicare direttamente il (tridecafluoro-1,1,2,2-tetraidroottil)-1-triclorosilano al wafer SU-8.
- Chiudere bene la camera del vuoto e accendere una pompa del vuoto per almeno 2 ore.
- Prendi un bicchiere di plastica e versa l'elastomero siliconico (ad es. Silpot 184 o equivalente, Sylgard 184) e l'agente indurente con un rapporto in peso di 10:1. Quindi, mescolare bene con una spatola e degassare nella camera a vuoto fino a rimuovere completamente le bolle.
- Versare la miscela PDMS nel contenitore con il wafer SU-8 allo spessore desiderato (3-4 mm) e degassare nuovamente per eliminare le bolle.
- Cuocere il PDMS in forno a 60 °C per almeno 3 ore per indurire completamente il PDMS.
- Dopo il raffreddamento, tagliare il PDMS indurito dal wafer utilizzando un bisturi o una lama di rasoio.
- Per creare le due camere del chip di coltura tissutale, praticare due fori nei punti in cui si trovano i due scomparti utilizzando un punzone per biopsia di 1,5 mm di diametro.
- Per creare un serbatoio medio, preparare un'altra miscela PDMS (elastomero siliconico e agente indurente con un rapporto in peso di 10:1) e versarla in una nuova piastra Petri da 10 cm. Regolare il volume di versamento a 5 mm di spessore del PDMS.
- Cuocere il PDMS in forno a 60 °C per almeno 3 ore per indurire completamente il PDMS.
- Dopo aver raffreddato il PDMS, tagliare il PDMS polimerizzato con un bisturi per ottenere un anello rettangolare.
- Incollare lo strato inferiore con il serbatoio del fluido applicando PDMS non polimerizzato tra di loro e cuocendo gli strati PDMS assemblati. Questa struttura legata si traduce nel chip di coltura tissutale PDMS.
- Pulire il chip di coltura tissutale PDMS con nastro adesivo per rimuovere polvere e piccole particelle dalla superficie. I chip per colture tissutali PDMS possono essere conservati a temperatura ambiente se protetti da polvere e raggi UV.
3. Preparazione della cultura
- Terreno di coltura
nota: Tutti i terreni elencati di seguito devono essere filtrati per la sterilizzazione, salvo diversa indicazione. I terreni preparati possono essere conservati a 4 °C e utilizzati entro un mese.
- Per preparare il terreno mTeSR Plus: combinare un flacone da 100 ml di integratore mTeSR Plus 5x con un flacone da 400 ml di terreno basale mTeSR Plus.
- Per preparare 100 ml di terreno KSR: in 85 ml di Dulbecco's Modified Eagle Medium o DMEM/F12, aggiungere 15 ml di siero sostitutivo Knockout (KSR, 15%), 1 ml di integratore di glutammina commerciale (1%) e 1 ml di aminoacido non essenziale (NEAA, 1%).
- Per preparare 100 ml di terreno N2: in 100 ml di terreno neurobasale, aggiungere 1 ml di N2 (100x), 1 ml di integratore di glutammina commerciale e 1 ml di NEAA.
- Per preparare 250 ml di terreno di maturazione: in 250 ml di terreno neurobasale, aggiungere 5 ml di B27 (2%), 2,5 ml di integratore di glutammina commerciale (1%) e 2,5 ml di penicillina/streptomicina (1%).
- Risospendere i composti (acido retinoico (RA), SB431542, LDN-193189, SU5402, DAPT, SAG, Y-27632) in DMSO per colture cellulari alla concentrazione desiderata. Preparare le aliquote e conservarle a -20 °C per un massimo di 6 mesi. Vengono utilizzate le seguenti soluzioni stock: 1 mM RA, 10 mM SB431542, 100 μM LDN-193189, 10 mM SU5402, 10 mM DAPT, 1 mM SAG, 10 mM Y-27632.
- Rivestimento
nota: Per prevenire la polimerizzazione della matrice della membrana basale da parte del calore, evitare cicli ripetitivi di gelo-disgelo. Se possibile, gestire tutte le procedure di rivestimento con puntali e provette per pipette pre-raffreddati. La matrice della membrana basale deve essere scongelata per una notte a 4 °C e aliquotata utilizzando puntali e provette per pipette pre-raffreddati. Le aliquote possono essere congelate a -20 °C o -80 °C.
- Scongelare l'aliquota congelata a 4°C con ghiaccio. L'aliquota deve essere mantenuta fredda durante la procedura di rivestimento. Utilizzando un puntale per pipetta pre-raffreddato, diluire la matrice della membrana basale con DMEM/F12 ghiacciato in un rapporto di 1:40. La matrice della membrana basale diluita non utilizzata può essere conservata a 4 °C per 2-3 giorni, dato che non si è verificata alcuna polimerizzazione.
- Aggiungere 1 mL della matrice della membrana basale/soluzione DMEM-F12 per rivestire un pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
- Incubare la piastra a temperatura ambiente per almeno un'ora, o 4 °C durante la notte. Le lastre rivestite possono essere conservate a 4 °C per un massimo di una settimana.
4. Manutenzione delle celle iPS
- Preparare i piatti rivestiti di matrice a membrana del seminterrato come menzionato in precedenza nel passaggio 3.2.
- Aspirare completamente il terreno mTeSR Plus. Lavare il pozzetto una volta con PBS e aggiungere 0,5 mL di reagente di passaggio (vedere la Tabella dei materiali). Attendere qualche secondo e aspirare la soluzione.
- Incubare la piastra a 37 °C nell'incubatore per 5 minuti o fino a quando le cellule diventano rotonde.
nota: Il tempo di incubazione può variare tra le diverse linee cellulari iPS e la confluenza. Si prega di controllare periodicamente al microscopio per determinare il tempo di dissociazione durante l'incubazione.
- Aggiungere 1 mL di terreno mTeSR Plus e picchiettare la piastra per 30-60 s per staccare le colonie.
- Miscelare delicatamente 1 mL di soluzione di sospensione cellulare con 7 mL di mTeSR plus fresco di terreno. Non pipettare più di 5 volte.
- Piastra con un rapporto di 1:8. In genere, aggiungere 1 mL di sospensione dal passaggio 5.5 e aggiungere 1 mL di mTeSR più terreno integrato con 5-10 μM di Y-27632 (inibitore ROCK). Il rapporto di diluizione del passaggio dipende dalla linea iPSC.
- Collocare la cella in un incubatore al 5% di CO2/37 °C. Il giorno successivo, rimuovere Y-27632 aggiungendo mTeSR Plus medium fresco. Successivamente, cambiare i terreni inizialmente a giorni alterni e ogni giorno man mano che la cella raggiunge una confluenza più elevata.
5. Differenziazione delle cellule iPS in motoneuroni
- iPSC passaging per la differenziazione dei motoneuroni
nota: La differenziazione può essere condotta con successo nel protocollo 3D (5.2).
- Lasciare crescere le cellule iPS indifferenziate fino a raggiungere una confluenza di circa l'80% nel terreno mTeSR Plus in una piastra a 6 pozzetti.
- Aspirare completamente il substrato. Lavare immediatamente il pozzetto una volta con PBS sterile e aggiungere 0,5 mL di soluzione di dissociazione cellulare alle cellule.
- Incubare la piastra a 37 °C nell'incubatore per circa 2-3 minuti, o fino a quando le cellule si separano e si arrotondano ma rimangono attaccate al pozzetto.
- Aggiungere 1 mL di terreno e pipettare delicatamente su e giù alcune volte utilizzando una pipetta sierologica da 5 mL. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 mL composta da 4 mL di terreno.
- Centrifugare a 200 x g per 3 min.
- Aspirare con cura il surnatante, lasciando il pellet indisturbato, e risospendere le cellule in 1 mL di terreno integrato con 10 μM di Y-27632.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e procedere a 5.2 (differenziazione 3D).
- Formazione di sferoidi motoneuronali (MNS) in differenziamento 3D ("protocollo 3D")
nota: Un cambio completo del medio viene effettuato quotidianamente dai giorni 0-12 di differenziazione (Figura 2).
- Seminare le cellule iPS dal passaggio 5.1.7 a una piastra inferiore a 96 pozzetti U a 40.000 cellule/pozzetto in 100 μL di mTeSR Plus integrato con 10 μM di Y-27632.
- Il giorno successivo, sostituire ogni pozzetto con 100 μl di terreno fresco.
- Nei giorni 0 e 1: aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con 100 μL di terreno KSR (3.1.2) integrato con 10 μM di SB431542 e 100 nM LDN-193189.
- Nei giorni 2 e 3: aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con 100 μL di terreno KSR integrato con 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 4 e 5: Preparare un terreno misto composto per il 75% da terreno KSR e per il 25% da terreno N2 (3.1.3). Quindi, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con 100 μL di terreno misto integrato con 10 μM SB431542, 100 nM LDN-193189, 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 6 e 7: Preparare un terreno misto composto per il 50% da terreno KSR e per il 50% da terreno N2. Quindi, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con 100 μL di terreno misto integrato con 5 μM di DAPT, 5 μM di SU5402, 1 μM di acido retinoico e 1 μM di SAG.
- Nei giorni 8 e 9: Preparare un terreno misto composto per il 25% da terreno KSR e per il 75% da terreno N2. Quindi, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con 100 μL di terreno misto integrato con 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Nei giorni 10 e 11: Sostituire il terreno con 100 μl di terreno N2 integrato con 5 μM DAPT, 5 μM SU5402, 1 μM RA e 1 μM SAG.
- Il giorno 12: procedere al trasferimento degli MN nel chip di coltura tissutale (Fase 6) o sostituire il terreno con 100 μL del terreno di maturazione (3.1.4) integrato con 20 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF).
nota: L'MNS può essere trasferito al chip di coltura tissutale a partire dal giorno 12 fino al giorno 19. Gli sferoidi che non vengono trasferiti devono essere conservati in coltura in piastre di fondo a 96 pozzetti U in terreno di maturazione integrate con 20 ng/mL di BDNF fino al trasferimento.
6. Preparazione del chip di coltura tissutale per la formazione di organoidi nervosi motori (MNO)
- Sterilizzare il PDMS preparato (dal passaggio 2.13) immergendolo in etanolo al 70% nella piastra di Petri per almeno 1 h.
nota: Tutti i passaggi seguenti devono essere manipolati in una cabina di biosicurezza.
- Sterilizzare il vetro del microscopio (76 x 52 mm) immergendolo in etanolo al 70% nella capsula di Petri.
- Durante il processo di essiccazione del vetro del microscopio, posizionare il dispositivo PDMS sul vetro del microscopio mezzo bagnato e lasciarlo asciugare completamente attendendo una notte. Una volta completamente asciugato, il dispositivo PDMS dovrebbe aderire al vetro.
nota: Questo legame non è permanente per consentire il distacco dei dispositivi PDMS dal vetro del microscopio dopo la coltura per la raccolta dei tessuti. L'incollaggio permanente con plasma di ossigeno può essere utilizzato per massimizzare l'adesione tra PDMS e vetro, ma vieterebbe lo smontaggio dei chip e la raccolta dei tessuti.
- Rivestire la superficie del microcanale con un dispositivo PDMS e un vetro da microscopio con 30 μL di matrice di membrana basamentale diluita in DMEM/F12 (1:40) creando una goccia su un lato dell'ingresso del canale e quindi aspirare la soluzione dall'altro lato dell'ingresso con una pipetta o una pompa di aspirazione (Figura 3A). Non aspirare troppo volume di soluzione per evitare la contaminazione da bolle.
- Quindi, incubare il dispositivo PDMS per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 °C in un contenitore secondario (ad es. piastra di Petri).
7. Formazione di organoidi nervosi motori (MNO)
- Sostituire la soluzione di rivestimento con 150 μL di terreno di maturazione preriscaldato integrato con 20 ng/mL di BDNF appena prima dell'uso.
- Quindi, posizionare l'MNS del passaggio 5.2.9 nell'ingresso del microcanale utilizzando una micropipetta con punta a foro largo. L'MNS può depositarsi spontaneamente nella parte inferiore del dispositivo per gravità. Non applicare troppa pressione durante l'iniezione del MNS (Figura 3B).
nota: Se l'MNS è bloccato sulla parete laterale di un foro in un chip di coltura tissutale, aspirare delicatamente la soluzione da un altro lato dell'ingresso.
- Riempire un piccolo serbatoio (ad esempio, un tappo di provetta da 15 mL) con acqua sterile e posizionarlo vicino al chip di coltura tissutale nel contenitore secondario per evitare l'evaporazione del mezzo. Quindi, metterlo in un incubatore al 5% di CO2/37 °C.
- Per un cambio di terreno, aspirare il terreno di coltura esausto dal centro del serbatoio del terreno (Figura 3C). Non aspirare tutto il terreno e il tessuto.
- Aggiungere delicatamente il terreno di maturazione fresco (con BDNF). Il mezzo deve essere cambiato ogni 2-3 giorni. Non asciugare il terreno di coltura in nessun momento durante la coltura. Gli assoni crescono da un MNS nel canale e si assemblano spontaneamente in un unico fascio in 2-3 settimane, il che provoca la formazione di un MNO. L'MNO può essere utilizzato per più di 1 mese aggiuntivo nel dispositivo.
