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1. Colture cellulari e predifferenziazione
- Coltura e predifferenziamento di cellule staminali neurali
- Preparare vetrini coprioggetti rivestiti in poli-D-lisina. Inserire un vetrino coprioggetti sterile (20 mm di diametro) in una piastra a 12 pozzetti. Rivestire il vetro di copertura con poli-D-lisina, 0,1% p/v, in acqua per una migliore adesione delle cellule sui vetrini coprioggetti seguendo i passaggi successivi.
NOTA: Le condizioni ottimali devono essere determinate per ogni linea cellulare e applicazione.
- Rivestire asetticamente la superficie del vetrino coprioggetto con poli-D-lisina, 0,1% p/v, in acqua. Oscillare delicatamente per garantire un rivestimento uniforme della superficie del vetrino coprioggetti.
- Dopo la coltura per una notte (~12 h) a 37°C, rimuovere la soluzione di poli-D-lisina e sciacquare la superficie 3 volte con 1 mL di acqua sterile.
- Asciugare le cellule almeno 30 minuti prima di seminarle.
- Coltura e predifferenziazione di cellule staminali neurali murine C17.2 (C17.2-NSC)
- Incubare le C17.2-NSC in un pallone da 25 cm2 nel terreno di Eagle's modificato di Dulbecco (DMEM) integrato con il 10% di siero fetale bovino (FBS), il 5% di siero di cavallo (HS) e l'1% di penicillina/streptomicina a 37 °C e il 5% di CO2 per ~2 - 3d.
- Quando le cellule raggiungono l'85% di confluenza, rimuovere il terreno, lavare le cellule con 1 mL di PBS e aggiungere 1 mL di tripsina fresca (0,25%) nel pallone. Lasciare agire per 1 minuto; quindi, aggiungere 1 mL di terreno di coltura al pallone e pipettare su e giù più volte per garantire una sospensione a singola cellula.
- Contare la densità delle cellule nella sospensione utilizzando un emocitometro. Calcolare il volume richiesto di sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di 2 x 104 cellule/mL.
- Seminare i C17.2-NSC sui vetrini coprioggetti rivestiti nella piastra a 12 pozzetti con una densità di ~2 x 104 celle per pozzetto. Controllare la densità cellulare al microscopio.
NOTA: Per un risultato migliore, la densità cellulare ottimale deve essere determinata prima dell'esperimento di immunofluorescenza.
- Incubare le cellule a 37°C in un incubatore cellulare per 12 ore per consentire l'adesione.
- Dopo l'attaccamento, lavare le cellule 2 volte con 1 mL di PBS e coltivare le cellule con un mezzo di differenziazione costituito da DMEM/F12 con integratore di N2 all'1% per 48 ore prima del trattamento al plasma.
- Coltura e predifferenziazione primaria di cellule staminali neurali di ratto
- Coltura della sospensione primaria di NSC (cellule staminali neurali) di ratto in terreno di crescita NSC di ratto in fiasche T25 non rivestite a una densità di 5 x 105 cellule.
- Controllare la formazione delle neurosfere al microscopio invertito. Assicurarsi che la morfologia delle neurosfere presenti complessi multicellulari sferici e trasparenti.
- Quando le neurosfere raggiungono un diametro di 3 mm o superiore, trasferire la sospensione della neurosfera in una provetta da centrifuga sterile da 15 ml e lasciare che le neurosfere si depositino per gravità.
- Rimuovere con cura il surnatante per lasciare le neurosfere in un volume minimo di terreno.
- Sciacquare le neurosfere 1 volta con 5 ml di PBS e lasciare che le neurosfere si depositino per gravità. Rimuovere il surnatante per lasciare un volume minimo di PBS.
- Aggiungere un volume adeguato di terreno di differenziazione per regolare la densità cellulare a ~12 - 15 neurosfere per millilitro. Il mezzo di differenziazione per le NSC primarie di ratto è costituito da DMEM/F12, 2% B27 e 1% FBS.
- Seminare 1 mL di sospensione di neurosfera su ciascun vetrino coprioggetti rivestito nella piastra a 12 pozzetti.
NOTA: Agitare delicatamente la piastra per assicurarsi che le neurosfere siano distribuite uniformemente. Questo passaggio è fondamentale per un migliore risultato dell'immunofluorescenza.
- Posizionare la piastra nell'incubatore e lasciarla predifferenziare per 24 ore prima del trattamento al plasma.
2. Preparazione dei getti di plasma
- Scegliere un tubo di quarzo semiaperto con un diametro interno di 2 mm e un diametro esterno di 4 mm. Inserire un filo ad alta tensione con un diametro di 2 mm nel tubo.
- Inserire il tubo di quarzo con il filo ad alta tensione in una siringa da 5 ml e utilizzare un supporto per montarlo all'interno del centro della siringa. Impostare la distanza tra l'estremità sigillata del tubo di quarzo e la punta della siringa a 1 cm.
- Collegare un tubo di gomma siliconica da 1 m (con un diametro interno di 12 mm) all'estremità aperta della siringa, quindi collegarlo in sequenza al flussometro e alla valvola del gas.
3. Acquisizione dei Jets
- Collegare il circuito come mostrato nella Figura 1. Collegare il cavo di uscita dell'alimentatore al dispositivo a getto di plasma, quindi collegare la punta della sonda ad alta tensione con il cavo di uscita per rilevare la tensione. Collegare l'altra estremità della sonda ad alta tensione all'oscilloscopio per registrare le informazioni sulla tensione di uscita. Controllare l'intero circuito e assicurarsi che l'alimentatore, l'oscilloscopio e la sonda ad alta tensione siano tutti collegati a terra.
- Controllare la linea del gas. Assicurarsi che il tubo del gas sia stato collegato al dispositivo a getto di plasma; quindi, aprire la valvola del gas dell'elio (frazione in volume, 99,999%) e dell'ossigeno (frazione in volume, 99,999%) e impostare il flusso di gas su 1 L : 0,01 L/min (He:O2).
NOTA: Lasciare fluire il gas per alcuni minuti prima di riaccendere l'alimentazione per la prima volta.
- Impostare l'ampiezza, la frequenza e l'ampiezza dell'impulso rispettivamente su 8 kV, 8 kHz e 1600 ns. Controllare di nuovo il circuito, quindi attivare il pulsante di uscita per creare un getto di plasma.
ATTENZIONE: Non toccare mai l'alto volumetage filo.
4. Trattamento al plasma delle cellule staminali neurali
- Impostare la distanza tra l'ugello della siringa e il foro del pozzetto della cella a 15 mm.
NOTA: La distanza viene misurata dal fondo della piattaforma in cui è posizionata la piastra a 12 pozzetti.
- Estrarre la piastra a 12 pozzetti dall'incubatore e cambiare il mezzo delle cellule predifferenziate a 800 μl di terreno di differenziazione fresco.
- Dividere le cellule in tre gruppi: un gruppo di controllo non trattato, un gruppo di trattamento del flusso di gas He-and-O2 (1%) di 60 s e un gruppo di trattamento al plasma di 60 s><.
NOTA: Non vi è alcuna perdita evidente di liquidi nelle condizioni di trattamento.
- Posizionare la piastra a 12 pozzetti sotto i getti di plasma, assicurarsi che l'ugello della siringa sia fissato al centro di ciascun foro e somministrare il trattamento pertinente ai diversi gruppi menzionati al punto 4.3.
NOTA: I controlli non trattati sono stati mantenuti in mezzo di differenziazione a temperatura ambiente durante la procedura sperimentale per garantire condizioni di trattamento uniformi. Il gruppo di trattamento del flusso di gas He-and-O2 (1%) è stato trattato con un solo flusso di gas He e O2 (1%), senza generazione di plasma. Tutti i trattamenti devono essere eseguiti in triplice copia.
5. Differenziazione delle cellule staminali neurali
- Dopo il trattamento, rimuovere la coltura originale e aggiungere 1 mL di nuovo terreno di differenziazione a ciascun pozzetto.
- Incubare le cellule nell'incubatore a 37°C e 5% di CO2 per 6 giorni. Cambiare il terreno a giorni alterni.
- Controllare quotidianamente lo stato di differenziazione dei diversi gruppi con un microscopio ottico a contrasto di fase invertito Figura 2. Seleziona casualmente almeno 12 campi e scatta foto per registrare i cambiamenti morfologici.
