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1. Preparazione dei Media
NOTA: Riscalda tutti i media a 37 ° C prima dell'uso in coltura cellulare.
- Terreno di coltura per fibroblasti embrionali di topo (MEF) (per la preparazione di 500 mL)
- Aggiungere 50 ml di siero fetale bovino (FBS) a 449 ml di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) e filtrare attraverso un'unità filtrante per pori da 500 ml da 0,22 μm.
- Aggiungere 1 mL di agente antimicrobico (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare il terreno a 4 °C per un massimo di 1 mese o aliquota e conservare a ≤ -20 °C.
- Terreno N2 (per la preparazione di 500 mL)
- Aggiungere 5 mL di L-alanina-L-glutammina (100x) e 500 μL di 2-Mercaptoetanolo (55 mM) a 489,5 mL di DMEM: Miscela di nutrienti F-12 (DMEM/F-12) e filtrare attraverso un'unità filtrante per pori da 500 mL da 0,22 μm.
- Aggiungere 1 mL di agente antimicrobico (50 mg/mL) e 5 mL di integratore N2-B dopo la filtrazione. Conservare il supporto a 4 °C al buio per un massimo di 1 mese.
- Terreno di crescita privo di siero (KSR) (per la preparazione di 500 mL)
- Aggiungere 75 ml di integratore di terreno privo di siero, 5 ml di L-glutammina (100x), 5 ml di aminoacidi non essenziali MEM (MEM-NEAA) (100x) e 500 μl di 2-mercaptoetanolo (55 mM) a 413,5 mL di DMEM non contenente glutammina e filtrare attraverso un'unità filtrante per pori da 500 mL da 0,22 μm.
- Aggiungere 1 mL di agente antimicrobico (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare il supporto a 4 °C per un massimo di 1 mese.
- Terreno di coltura con cellule staminali embrionali di topo (per la preparazione di 500 mL)
- Aggiungere 75 mL di FBS di grado di cellule staminali, 5 mL di MEM-NEAA (100x), 5 mL di L-glutammina (100x) e 500 μL di 2-Mercaptoetanolo (55 mM) a 413,5 mL di DMEM non glutamminato e filtrare attraverso un'unità filtrante per pori da 500 mL da 0,22 μm.
- Aggiungere 1 mL di agente antimicrobico (50 mg/mL) dopo la filtrazione. Conservare il terreno a 4 °C al buio per un massimo di 1 mese o aliquota e conservare a ≤ -20 °C.
2. Coltivare mESC
- Piastra le cellule feeder di MEF mitoticamente inattive in terreni MEF su piastre trattate con coltura tissutale a 3-4 x 104 cellule/cm2. Attendere almeno 12 ore affinché si stabilizzino in un incubatore per colture cellulari a 37 °C con ≥ 95% di umidità relativa e 5% di CO2 2 prima di colorare le mESC. Se non viene utilizzato immediatamente, sostituire il supporto MEF ogni 3 giorni. Smaltire i MEF se non utilizzati entro 7 giorni dalla placcatura.
- Aggiungere le mESC (intervallo di densità da 1 a 4 x 104 cellule/cm2) alle piastre MEF in terreni mESC contenenti il fattore inibitorio della leucemia di topo (mLIF) (1.000 U/mL). Incubare le cellule a 37 °C con ≥ 95% di umidità relativa e 5% di CO2.
- Passaggio di mESC utilizzando tripsina-EDTA (0,05% tripsina) (1:5-1:10) una volta che la piastra diventa ~ 70-80% confluente o se le colonie iniziano a toccarsi. Questo si verifica in genere ogni 2 giorni, ma può richiedere fino a 4 o 5 giorni, a seconda della densità iniziale della placcatura.
- Mantenere le mESC su uno strato di alimentazione MEF in un mezzo mESC per mantenere la pluripotenza.
- Prima di iniziare la differenziazione, far passare le cellule almeno una volta su piastre rivestite di gelatina senza MEF per diluire i MEF.
- Preparare le piastre rivestite di gelatina aggiungendo lo 0,1% di gelatina in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) con Ca2+/Mg2+ a una piastra trattata con coltura tissutale e lasciandola a 37 °C per almeno 1 ora. Piastra 1,5-2 x 106 cellule/piastra da 10 cm (2,7-3,6 x 104 cellule/cm2) e lasciare che le cellule si espandano per 2 giorni prima di iniziare la differenziazione.
3. Differenziare le mESC verso progenitori telencefalici simili a MGE
- Giorno di differenziazione (DD) 0 = "celle galleggianti"
- Dopo che le mESC sono cresciute su piastre rivestite di gelatina per 2 giorni, aspirare il terreno e lavare le cellule una volta con PBS senza Ca2+/Mg2+. Aggiungere una quantità sufficiente di tripsina-EDTA (0,05% di tripsina) per coprire la superficie della piastra (in genere 4 ml di tripsina-EDTA per una piastra di coltura tissutale da 10 cm) e riposizionare le cellule nell'incubatore a 37 °C con ≥95% di umidità relativa e 5% di CO2 per 4 minuti.
- Dopo 4 minuti, spegnere la tripsina-EDTA utilizzando 2 volte il volume con terreni mESC. Trasferire le celle in una provetta da centrifuga di dimensioni adeguate e centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti. Dopo 5 minuti, rimuovere il tubo e aspirare il fluido senza disturbare il pellet. Risospendere il pellet in un terreno KSR:N2 da 1 mL (1:1) contenente l'inibitore BMP LDN-193189 (250 nM) e l'inibitore Wnt XAV-939 (10 μM).
- Misurare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Iniziare a coltivare cellule come corpi embrioidi (EB) aggiungendo 75.000 cellule/mL in terreno KSR:N2 (1:1) contenente LDN-193189 (250 nM) e XAV-939 (10 μM) in piastre di coltura tissutale non aderenti. Incubare le cellule a 37 °C con ≥ 95% di umidità relativa e 5% di CO2.
- Su DD1, prepararsi per l'"atterraggio" cellulare rivestendo le piastre trattate con coltura tissutale con poli-L-lisina (10 μg/mL in PBS con Ca2+/Mg2+) per una notte (O/N) a 37 °C con ≥ 95% di umidità relativa o per almeno 1 ora.
- Su DD2, aspirare la poli-L-lisina e rivestire le piastre con laminina (10 μg/mL in PBS con Ca2+/Mg2+) O/N a 37 °C con ≥ 95% di umidità relativa.
nota: Sebbene l'O/N sia ottimale, possono essere sufficienti solo 2 ore. Se le piastre non vengono utilizzate entro il giorno successivo, aspirare la laminina, sostituirle con PBS senza Ca2+/Mg2+ e conservare a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- DD3 ("celle terrestri")
- Prima di iniziare la dissociazione dell'EB, aspirare la laminina e lasciare asciugare completamente le piastre in una cappa di coltura tissutale. Non utilizzare piastre che appaiono lucide o visibilmente bagnate. Trasferire gli EB con il terreno in una provetta da 15 mL e centrifugare per 3-4 minuti a 15 x g o fino a quando gli EB non sono pellettati.
- Aspirare il terreno e aggiungere 3 mL di soluzione di distacco cellulare contenente DNasi (2 U/mL) e incubare a 37 °C con ≥ 95% di umidità relativa e 5% di CO2 per 15 minuti. Muovere delicatamente la provetta ogni 3 minuti per favorire la dissociazione dell'EB.
- Una volta che gli EB non sono più visibili o sono trascorsi 15 minuti, aggiungere 6 mL di KSR:N2 (1:1) contenente DNasi (1 U/mL) e centrifugare per 5 minuti a 200 x g.
- Piastra le cellule in KSR:N2 (1:1) contenente LDN-193189 (250 nM), XAV-939 (10 μM) e l'inibitore ROCK Y-27632 (10 μM) a 4,5-5 x 104 cellule/cm2.