Generazione di progenitori neurali da cellule staminali embrionali di topo con il metodo della goccia sospesa

Abstract

Fonte: Hanafiah, A., et al. Differenziazione e caratterizzazione di progenitori neurali e neuroni da cellule staminali embrionali di topo. J. Vis. Exp. (2020).

Il video dimostra la differenziazione delle cellule staminali embrionali di topo (mESC) in corpi embrioidi (EB) con il metodo della goccia sospesa. Dopo aver sospeso le mESC in gocce sospese e incubate, le cellule si aggregano per formare EB, che vengono ulteriormente differenziate in cellule progenitrici neuronali (NPC) utilizzando un mezzo di differenziazione integrato con acido retinoico (RA).

Protocollo

1. Cultura mESC

1. Rivestire una piastra trattata con coltura tissutale da 10 cm con gelatina allo 0,1% e lasciare che la gelatina si solidifichi per almeno 15-30 minuti prima di aspirarla.
2. Seme γ fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati un giorno prima di coltivare le mESC nel terreno mESC preriscaldato (Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) con il 15% di siero fetale bovino (FBS), aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina/streptomicina, piruvato di sodio, fattore inibitorio della leucemia (LIF), PD0325901 (PD) e CHIR99021 (CH)).
3. Lasciare che i MEF irradiati con γ si depositino e si attacchino alla superficie della piastra prima di coltivare le cellule E14.
4. Scongelare le ESC E14 in bagnomaria a 37 °C e trasferire rapidamente le cellule in una provetta conica da 15 cm con terreno mESC caldo. Pellettare le celle a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
5. Risospendere le cellule in 10 mL di terreno mESC e piastreggiare le cellule sulla piastra di coltura contenente i MEF irradiati con γ seminati in precedenza. Incubare la coltura cellulare in un incubatore a 37 °C sotto il 5% di CO₂.
6. Per il passaggio della coltura, aspirare il terreno e lavare la piastra con 1 soluzione fisiologica tamponata con fosfato (PBS) sterile. Aggiungere una quantità di tripsina sufficiente allo 0,05% per coprire la superficie della piastra e incubare a 37 °C per 3 minuti.
7. Neutralizzare la tripsina con il terreno mESC e la pipetta per generare una sospensione a singola cellula. Centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
8. Contare le cellule con un emocitometro o un contacellule e seminare circa 5,0 x 10⁵ cellule in una piastra di coltura di 10 cm.
9. Risospendere le cellule in 10 mL di terreno mESC, piastrarle sulla piastra di coltura tissutale rivestita di gelatina e incubare le colture come descritto in precedenza.
   nota: Si raccomanda di far passare le mESC ogni 2 giorni per evitare che le cellule si differenzino nelle loro colonie. Il rosso fenolo nel mezzo funziona esclusivamente come indicatore di pH e, a seconda della densità cellulare, può diventare giallastro (più acido), prima di 2 giorni. Pertanto, potrebbe essere necessario cambiare il mezzo ogni giorno. I MEF irradiati con γ alla fine moriranno dopo un paio di passaggi.

2. EB, NPC e differenziazione neuronale

1. Eseguire il protocollo di passaggio della coltura e contare le cellule.
2. Metodo della goccia sospesa (giorno 0)
   1. Per una piastra di coltura cellulare di 10 cm, contare circa 2,5 x 10⁴ cellule di cui 5,0 x 10² cellule saranno sospese in un terreno di differenziazione da 20 μL (DMEM con il 15% di FBS, aminoacidi non essenziali, β-mercaptoetanolo, L-glutammina, penicillina/streptomicina e piruvato di sodio). Circa cinquanta goccioline da 20 μl contenenti le cellule possono essere piastrate su una piastra da 10 cm.
   2. Aliquotare il numero appropriato di cellule, quindi centrifugare le cellule a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante.
   3. Risospendere le cellule nel volume appropriato di terreno di differenziazione per una densità cellulare di 5,0 x 10² cellule per 20 μL (ad esempio, 2,5 x 10⁴ cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione).
   4. Utilizzando una micropipetta o una pipetta a ripetizione, posizionare 20 μl di goccioline della sospensione cellulare sul coperchio della piastra di coltura tissutale. Assicurarsi che le goccioline non siano troppo vicine l'una all'altra per evitare che si fondano.
      nota: Le goccioline possono essere piastrate su una piastra di fissaggio trattata con coltura tissutale o su una piastra di sospensione, in quanto verranno posizionate sul coperchio e non sulla piastra stessa. Per un approccio più fattibile e sterile, piastrate le goccioline su una piastra di coltura tissutale di attacco e trasferitele su una piastra di sospensione come descritto di seguito.
   5. Riempire la piastra con 5-10 ml di 1x PBS e rimettere con cura il coperchio sulla piastra. Incubare la coltura nell'incubatore a 37 °C.
      nota: Il PBS viene aggiunto alla piastra di coltura per evitare che le goccioline si secchino.
3. Il giorno 2, utilizzare una micropipetta per raccogliere le goccioline dal coperchio e posizionarle in una piastra di sospensione per colture cellulari da 10 cm riempita con 10 mL di terreno di differenziazione. Incubare la coltura su un agitatore orbitale agitando a bassa velocità nell'incubatrice.
4. Il giorno 4, per raccogliere gli EB, raccogliere le cellule, centrifugare a 200 x g per 3 minuti e rimuovere il surnatante><. nota: Gli EB possono anche essere lavati con 1x PBS secondo i requisiti degli esperimenti successivi.
5. Per continuare la procedura e indurre la differenziazione dell'EB in cellule progenitrici neurali (NPC), preparare il terreno di differenziazione con 5 μM di acido retinoico (RA).
6. Rimuovere il vecchio terreno pellettando gli EB a 100 x g per 3 minuti o lasciare che gli EB si depositino prima di aspirare il vecchio terreno. Aggiungere 10 mL di terreno di differenziazione contenente 5 μM di AR alla piastra di coltura.
7. Il giorno 6, sostituire almeno metà del terreno con un terreno fresco contenente 5 μM di AR inclinando la piastra e pipettando il terreno come descritto sopra.
   nota: Si raccomanda di sostituire almeno la metà del terreno con un terreno fresco contenente AR nei giorni 5 e 7. Prendere nota dell'indicatore rosso fenolo; Se diventa giallastro, è meglio sostituire tutto il substrato.
8. Il giorno 8, raccogli gli NPC raccogliendo le cellule, centrifugando a 200 x g per 3 minuti e rimuovendo il surnatante.
   nota: Gli NPC possono anche essere lavati con 1x PBS in base alle esigenze degli esperimenti successivi. Se necessario, gli NPC possono essere congelati e scongelati di nuovo per una successiva coltura e analisi. Se gli NPC devono essere coltivati, l'accutasi può essere utilizzato anche come alternativa alla tripsina.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
0,05% tripsina + 0,53 mM EDTA 1X	Corning	25-052-CV
0,1% Gelatina	sigma	G1890-100G	Preparato in acqua deionizzata
CHIR99021	Prodotti chimici delle Cayman	Codice: 13122
DMEM	Corning	10-017-CM
DMEM/F12 medio	Thermo Fisher Scientifico	11320033
Cuscinetto EB	Qiagen	Anno 19086
etanolo	111000200	Pharmco	Diluito in acqua deionizzata
Siero fetale bovino	Atlanta Biologicals	S10250
L-glutammina	Thermo Fisher Scientifico	25030024
Lif	N/A	N/A	Raccolto dal surnatante MEF
MEM Aminoacidi non essenziali	Corning	25-025-CL
PD0325901	Prodotti chimici delle Cayman	Codice 13034
Penicillina/streptomicina	Corning	30-002-CL
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	N/A	N/A	Preparato in acqua deionizzata
cloruro di potassio	P217-500G	VWR
Fosfato di potassio monobasico anidro	0781-500G	VWR
cloruro di sodio	BP358-10	Fisher Bioreagenti
Fosfato di sodio, bibasico, eptaidrato	SX0715-1	Milipore
Acido retinoico	sigma	Codice: R2625	Preparato in DMSO
Piruvato di sodio	Corning	25-000-cl
β-mercaptoetanolo	Fisher BioReagenti	BP176-100