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1. Induzione di cellule staminali neurali
NOTA: A seconda delle condizioni delle celle, circa 5 o 7 giorni dopo la trasfezione, le cellule aderenti al monostrato raggiungeranno il 30 - 50% di confluenza (Figura 1C).
- Rimuovere i surnatanti contenenti cellule e sfere galleggianti e quindi aggiungere 1 ml di terreno progenitore neurale (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12), contenente 1x integratore di N2, 0,1% (p/v) di albumina sierica bovina (BSA), 1% (v/v) di antibiotici, 20 ng/ml di fattore di crescita dei fibroblasti basici (bFGF) e 20 ng/ml di fattore di crescita epidermico (EGF)) nelle cellule aderenti.
- Facoltativamente, dissociare le sfere cellulari pipettando delicatamente e centrifugando le cellule a 170 x g per 10 minuti. Rimuovere il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml di terreno progenitore neurale in una nuova piastra a 24 pozzetti rivestita con matrigel secondo le istruzioni come backup.
- Cambiare il terreno a giorni alterni fino a quando le cellule raggiungono il 60 - 80% di confluenza, di solito dopo 1 settimana.
- Eliminare il surnatante e aggiungere 1 ml di terreno di cellule staminali neurali (terreno privo di siero, NSC SFM). Dissociare le cellule utilizzando un raschietto cellulare, seguito da un pipettaggio molto delicato.
- Rimuovere le cellule e seminarle tutte in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Aggiungere un altro 1 ml di terreno di coltura di cellule staminali neurali per ottenere 2 ml di terreno per ogni pozzetto. Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2.
- Cambia il mezzo a giorni alterni.
- Quando le cellule raggiungono il 60% di confluenza, dissociare e riplaccare le cellule con un rapporto 1:3 seguendo i passaggi in 1.4 e 1.6.
