Silenziamento genico mediato da siRNA nelle cellule staminali neurali

Abstract

Fonte: Nguyen, B. H., et al. Coltura e manipolazione delle cellule neurali O9-1. J. Vis. Exp (2018)

Questo video dimostra l'uso di piccoli RNA interferenti (siRNA) per silenziare specifici geni di interesse nelle cellule staminali neurali e differenziarli nei tipi di cellule desiderati utilizzando un mezzo di differenziazione appropriato. Questa procedura consente lo studio del ruolo critico di specifici geni nel processo di differenziazione delle cellule staminali neurali.

Protocollo

1. Manipolazione delle cellule O9-1

1. Esecuzione del knockdown di siRNA nelle cellule O9-1
   1. Scongelare e rivestire una piastra a 24 pozzetti con una matrice a membrana basale prima di iniziare l'esperimento. Recupera e semina le cellule O9-1, consentendo loro di crescere fino al 60-80% di confluenza.
   2. Diluire i liposomi in terreni privi di siero secondo il volume del pozzetto appropriato. Diluire il siRNA in terreni privi di siero fino al finale. Aggiungere siRNA diluito ai liposomi diluiti in un rapporto raccomandato dal produttore. Mescolare bene pipettando e quindi incubare.
      nota: Segui la guida del produttore sul volume utilizzato, il tempo e la temperatura di incubazione.
   3. Aggiungere un volume appropriato di complesso siRNA-lipidi alle cellule secondo le raccomandazioni del produttore.
   4. Incubare le cellule per 24 ore in un incubatore per colture cellulari standard (37 °C, 5% CO₂). Eseguire le fasi a valle appropriate (estrazione dell'RNA, estrazione delle proteine, colorazione, ecc.)
      NOTA: i tempi e le concentrazioni di knockdown dei siRNA possono variare a seconda del singolo esperimento.

2. Differenziazione cellulare O9-1

1. Differenziazione delle cellule O9-1 in osteoblasti
   1. Per preparare i terreni di differenziazione osteogenica, diluire i seguenti in alfa-MEM (sono indicate le concentrazioni finali): 0,1 μM di desametasone, 100 ng/mL di proteina morfogenetica ossea 2 (BMP2), 50 μg/mL di acido ascorbico, 10 mM di b-glicerofosfato, 10% di FBS, 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina.
   2. Rilevare il marcatore degli osteoblasti, l'osteocalcina, negli osteoblasti differenziati mediante immunocolorazione, come mostrato nella Figura 1.
      NOTA: La differenziazione osteogenica può essere valutata anche utilizzando altri marcatori di osteoblasti o con colorazione con rosso alizarina o colorazione con fosfatasi alcalina.
2. Differenziazione delle cellule O9-1 in cellule muscolari lisce
   1. Per preparare i terreni di differenziazione delle cellule muscolari lisce, diluire quanto segue in DMEM (sono indicate le concentrazioni finali): 100 U/mL di penicillina, 100 μg/mL di streptomicina e 10% di FBS.
   2. Valuta la differenziazione delle cellule muscolari lisce con la colorazione in immunofluorescenza utilizzando anticorpi contro i marcatori delle cellule muscolari lisce, come l'actina della muscolatura liscia (SMA), mostrata come esempio nella Figura 2.

Risultati

Figura 1: Colorazione in immunofluorescenza del marcatore degli osteoblasti osteocalcina (Ocn) che indica che le cellule O9-1 hanno dato origine a cellule osteoblastiche in condizioni di differenziazione osteogenica. Le cellule sono state colorate con l'anticorpo Ocn marcatore degli osteoblasti (verde) e i nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). Le frecce indicano le celle Ocn-pos...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linea cellulare della cresta neurale cranica di topo O9-1	Millipore Sigma	SCC049
DMEM, glicemia alta, senza glutammina	Gibco	Codice 11960-044
DMEM, glicemia alta	Clone	SH30243.01
FBS (siero fetale bovino)	Millipore Sigma	ES-009-B
Penicillina - streptomicina	Gibco	Codice: 15140-122
L-glutammina 200mM (100X)	Gibco	Codice 25030-081
Tripsina-EDTA 0,25% in HBSS	Genesee Scientifico	25-510
DPBS (soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco) senza calcio o magnesio	Lonza	17-512F
Aminoacidi non essenziali MEM (MEM NEAA) 100X	Gibco	Codice 11140-050
Piruvato di sodio (100mM)	Gibco	Codice 11360-070
2-mercaptoetanolo	sigma	Codice: M-7522
Fattore di crescita dei fibroblasti umani ricombinante-basico (rhFGF-basic)	Sistemi di ricerca e sviluppo	233-FB-025
Mitomicina C	Roche	10107409001
Matrice di Matrigel	Corning	356234
DMSO (dimetilsolfossido)	Millipore Sigma	MX1458-6
Lipofectamina RNAiMAX	Thermo Fisher Scientifico	Codice 13778-075
Opti-MEM I (1X)	Gibco	Codice 31985-070
Terreno essenziale minimo, alfa 1X con sali di Earle, ribonucleosidi, desossiribonucleosidi e L-glutammina	Corning	10-022-CV
SiRNA Wwtr1 su TARGETplus	Dharmacon	L-041057
Pool non di puntamento ON-TARGETplus	Dharmacon	D-001810
SiRNA di Yap1 su TARGETplus	Dharmacon	L-046247
FCS (siero fetale di vitello)
ITS (insulina-transferrina-selenio )
TGF-b3
acido ascorbico
BMP2 (proteina morfogenetica ossea 2)
desametasone
Supplemento B-27