Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Isolamento di colonie di cellule progenitrici neurali indotte putative (iNPC)
- Un giorno prima di raccogliere le colonie di iNPC, rivestire una piastra da 48 pozzetti con laminina: diluire la laminina a 1 μg/ml nella soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS), aggiungere 300 μl della soluzione sulle piastre e mantenere a 4 °C per 24 ore. Il giorno dopo, aspirare la laminina dalle piastre e aggiungere 200 μl di terreno di neuroinduzione (1:1 DMEM/F-12:Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 1% GlutaMAX, 10 ng/ml di fattore inibitorio della leucemia umana, 3 μM CHIR99021, 2 μM SB431542) ai pozzetti.
- Lavare una volta con DPBS le piastre a 6 pozzetti contenenti le colonie da prelevare e aggiungere 2 ml di terreno di neuroinduzione per pozzetto di piastra a 6 pozzetti. Scegli le colonie meccanicamente: raschia le colonie usando un ago sottile per sbarazzarti delle cellule circostanti; Impostare il pipetman da 200 μl su 50 μl e prelevare le colonie utilizzando i rispettivi puntali per pipette.
- Trasferire una colonia in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti rivestita di laminina e generare meccanicamente una singola sospensione cellulare pipettando su e giù 10 volte. Aggiungere alle cellule l'inibitore ROCK Y27632 in una concentrazione finale di 10 μM.
- Far crescere le cellule sulla piastra a 48 pozzetti a 37 °C, 5% CO2 per 2 giorni. Sostituire il terreno ogni due giorni fino a quando le celle raggiungono l'80 - 90% di confluenza (circa 3 - 4 giorni).
