$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparazione di piastre a 24 pozzetti per colture di neuroni ad alta densità
NOTA: Esegui i seguenti passaggi (2-3) il giorno prima del prelievo pianificato di embrioni.
- Inserire due piastre da 24 pozzetti nella cappa per colture cellulari e aprire la confezione individuale.
- Collegare un ago per siringa da 18 G a una siringa monouso di plastica da 1 ml.
- Tenere la siringa e puntare la punta dell'ago a ~1 mm a sinistra del centro del fondo del pozzetto. Applicare una forza moderata (~250 g) per incidere il fondo del pozzetto (~1 mm di lunghezza). Si formerà una scanalatura e i materiali plastici spostati formeranno un supporto rialzato sopra la superficie del pozzo a fondo piatto. Incidere in modo simile un'altra scanalatura parallela lunga ~1 mm a ~1 mm a destra del centro del fondo.
- Ripetere questo passaggio per tutti i pozzetti delle due piastre da 24 pozzetti. Le due piastre da 24 pozzetti utilizzate per la coltura ad alta densità sono ora pronte per il rivestimento con poli-D-lisina (vedere il passaggio 2.8 di seguito).
2. Preparazione dei vetrini coprioggetti per colture di neuroni a bassa densità
- Utilizzare un vetro rotondo #12 da 12 mm di diametro.
- Collocare 50 vetrini coprioggetti all'interno di una capsula di Petri di plastica sterile di 100 mm di diametro e immergere i vetrini coprioggetti in 20 ml di soluzione di etanolo al 70%. Posizionare questa capsula di Petri su una piattaforma rotante con rotazione a velocità moderata (70 giri/min) per un'ora. Rimuovere l'etanolo al 70% e quindi sostituirlo con un nuovo lotto di etanolo al 70%. Ruotare e lavare per un'altra ora.
- Scartare la soluzione detergente al 70% di etanolo. Aggiungere acqua sterile (filtrata attraverso un'unità filtrante da 0,2 μm). Sciacquare rigorosamente i vetrini coprioggetti ruotando manualmente la capsula di Petri. Risciacquare tre volte, ogni volta sostituendo con acqua fresca sterile.
- Posizionare la capsula di Petri con i vetrini coprioggetti all'interno di una cappa sterile per colture cellulari a flusso laminare. Aspirare l'acqua di risciacquo attraverso la linea del vuoto e aggiungere 10 ml di acqua sterile filtrata per immergere i vetrini. I vetrini coprioggetti devono essere sterili e la superficie deve essere sufficientemente pulita per il rivestimento in poli-D-lisina.
- Aprire due piastre da 24 pozzetti dalla loro confezione individuale e posizionarle nella cappa.
- Accendere la linea del vuoto nella cappa. Collegare un puntale per pipetta da 200 μl alla linea del vuoto e utilizzare una forbice per tagliare il puntale in modo da creare un'apertura più ampia.
- Usa una pinzetta a punta fine #5 per raccogliere i vetrini coprioggetti dalla capsula di Petri, uno alla volta, e usa la linea del vuoto per asciugare completamente il vetrino coprioggetti. Quindi posizionare un vetrino coprioggetti in ciascuno dei pozzetti della piastra a 24 pozzetti. I 50 vetrini coprioggetti puliti dovrebbero essere sufficienti per riempire ciascuno dei pozzetti delle due piastre da 24 pozzetti.
- Diluire la soluzione madre di poli-D-lisina (1 mg/ml) in una soluzione di lavoro (0,1 mg/ml) con un tampone borato (pH 8,5). Per le quattro piastre da 24 pozzetti (comprese due piastre ad alta densità con fondo inciso), preparare 30 ml di soluzione di lavoro totale.
- Aggiungere 300 μl di soluzione di lavoro di poli-D-lisina 0,1 mg/ml a ciascun pozzetto con vetrini coprioggetti. Assicurarsi che i vetrini coprioggetti siano completamente immersi nella soluzione. In caso contrario, utilizzare la punta della pinzetta #5 per premere i vetrini coprioggetti contro il fondo del pozzetto e utilizzare la punta per guidare la soluzione di poli-D-lisina per coprire tutta la superficie dei vetrini. Ispezionare visivamente tutti i vetrini coprioggetti per assicurarsi che non sia rimasta intrappolata aria tra la piastra e i vetrini.
- Aggiungere 300 μl di soluzione di lavoro di poli-D-lisina 0,1 mg/ml a ciascun pozzetto della piastra di coltura ad alta densità con fondo inciso. Ruotare a mano per stendere la soluzione in modo da coprire l'intero fondo del pozzetto.
- Rimettere tutte e quattro le piastre con poli-D-lisina nell'incubatore di coltura e incubare O/N.
3. Lavaggio e precondizionamento delle piastre per la coltura
NOTA: I seguenti passaggi (3-5) vengono eseguiti il giorno del prelievo del tessuto.
- Dopo l'incubazione/rivestimento dei vetrini coprioggetti e delle piastre O/N da 24 pozzetti, portare tutte e quattro le piastre (due con vetrini coprioggetti, due piastre accettori ad alta densità con fondo in plastica incisa) nella cappa di coltura. Utilizzare la linea del vuoto per rimuovere la soluzione di poli-D-lisina.
- Immediatamente dopo la rimozione della soluzione di poli-D-lisina, aggiungere ~1 ml di acqua sterile a ciascun pozzetto utilizzando una pipetta di trasferimento in plastica. Dopo che tutti i pozzetti sono stati riempiti d'acqua, lasciare riposare per 10 minuti. Rimuovere l'acqua con l'aspirapolvere, quindi aggiungere 300 μl di terreno di lavaggio in ogni pozzetto per coprire il fondo del pozzetto (con o senza vetrini coprioggetti). Non lasciare che il rivestimento in poli-D-lisina si asciughi.
- Rimettere tutte e quattro le piastre nell'incubatore cellulare. Le piastre sono pronte per l'uso una volta che i neuroni ippocampali dispersi sono stati preparati.
4. Placcatura dei neuroni e co-coltura a lungo termine
- Portare le due piastre da 24 pozzetti con fondo inciso per neuroni ad alta densità nella cappa di coltura cellulare. Rimuovere il mezzo di precondizionamento da 300 μl sottovuoto. Piastra con sospensioni cellulari ad alta densità da 0,6 ml a 250.000 neuroni/ml.
- Portare le altre due piastre da 24 pozzetti con vetrini coprioggetti nella cappa di coltura e rimuovere il terreno di precondizionamento da 300 μl mediante vuoto. Piastre con sospensioni cellulari a bassa densità da 0,6 ml a 10.000 neuroni/ml sui vetrini coprioggetti all'interno delle due piastre a 24 pozzetti.
- Rimettere tutte e quattro le piastre a 24 pozzetti nell'incubatore. Lasciare riposare per 2 ore.
- Capovolgere i vetrini coprioggetti a bassa densità con i neuroni aderenti alla coltura ad alta densità. Assicurati che i neuroni siano uno di fronte all'altro (cioè non separati dal vetrino coprioggetti). Quindi rimettere le due piastre con la co-coltura nell'incubatrice.
5. Sostenere la co-cultura
- Alimentare le co-colture aggiungendo 300 μl di terreno fresco per mangimi (vedi Materiali) al giorno in vitro (DIV) 5. Non è necessario rimuovere il 50% del terreno di coltura completo originale, come riportato da molti altri studi. Il terreno di alimentazione contiene anche 15 μM di citosina arabinoside (Ara-C, per ottenere una concentrazione finale di 5 μM) per ridurre al minimo la possibilità di contaminazione e proliferazione della glia.
- Dopo questa alimentazione iniziale, aggiungere 300 μl di terreno di alimentazione fresco senza Ara-C al pozzetto ogni settimana. Se la coltura viene conservata per più di un mese, sostituire metà del terreno con un terreno di alimentazione fresco ogni settimana oltre un mese (con la prima metà del terreno di sostituzione al DIV33). Morfologicamente, sia i neuroni ad alta densità che quelli a bassa densità sembrano sani fino a tre mesi (il tempo più lungo osservato dagli sperimentatori).