Differenziazione delle cellule progenitrici neurali indotte in astrociti

Abstract

Fonte: Meyer, S., et al., Edenhofer, F. Derivazione di fibroblasti umani adulti e loro conversione diretta in cellule progenitrici neurali espandibili. (2015)

Questo video mostra il processo di differenziazione delle cellule progenitrici neurali indotte (iNPC) in neuroni e astrociti utilizzando mezzi specializzati.

Protocollo

1. Differenziazione degli iNPC

1. Differenziamento verso la linea neuronale
   1. Cellule di coltura su piastre rivestite di laminina come descritto sopra. Cambiare i terreni in neuro-diff-media (DMEM/F-12, 1x N2, 1x B27, 300 ng/ml di cAMP, 200 μM di vitamina C, 10 ng/ml di BDNF, 10 ng/ml di GDNF) quando le cellule sono confluenti per circa il 70%. Cambia i media a giorni alterni per tre settimane. Non dividere le cellule durante la differenziazione.
   2. Dopo tre settimane, le cellule dovrebbero esprimere il marcatore neuronale TUJ1. Per ottenere neuroni e sottotipi neuronali più maturi, continuare la differenziazione fino a 3 mesi.
2. Differenziazione verso la linea gliale
   1. Cambia i terreni in terreni di induzione gliale (1:1 DMEM/F-12: Neurobasal, 1x N2, 1x B27, 10 μM β-mercaptoetanolo, 100 μM di aminoacidi non essenziali, 1,5 mM di L-glutammina, 5 μg/ml di insulina, 40 ng/ml di T3) inclusi 20 ng/ml di EGF per indurre la differenziazione in cellule precursori gliali. Rimuovere metà del supporto e sostituirlo con un supporto fresco a giorni alterni per circa 2 settimane. Durante questo periodo, le cellule devono essere divise 1:3 in presenza dell'inibitore ROCK Y27632 da 10 μM quando viene raggiunta la confluenza del 100%.
   2. Dopo 2 settimane, differenziare ulteriormente le cellule in astrociti: quando le cellule sono quasi confluenti, cambiare i terreni in terreni astrocitari disponibili in commercio, cambiare i terreni ogni due giorni. Dopo circa 7 giorni, le cellule iniziano a esprimere marcatori astrocitari (ad esempio, GFAP). Se le cellule diventano confluenti al 100% durante il protocollo di differenziazione, dividerle in un rapporto 1:2 in presenza dell'inibitore ROCK Y27632 da 10 μM.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Terreni astrocitari	ScienCell	Anno 1801
B27	Tecnologie di vita	Codice 17504-044
BDNF	Peprotech	450-02
accampamento	sigma	Codice: A6885
DMEM	Tecnologie di vita	Codice 41966-029
DMEM F12	Tecnologie di vita	Codice 11320-033
Dmso	Roth	4720
DPBS	Tecnologie di vita	Codice 14190-094
FEG	Tecnologie per la vita	PHG0313
Fcs	Biochrom AG	Codice: 50115
GDNF	Peprotech	450-10
insulina	Seralab	GEM-700-112-P
L-Glutammina	Tecnologie di vita	Codice 25030-024
Laminina	sigma	L2020
N2	Tecnologie di vita	Codice 17502-048
Neurobasale	Tecnologie di vita	Codice 21103-049
Aminoacidi non essenziali	Tecnologie di vita	Codice 11140-050
vitamina C	sigma	Visualizzazione del materiale A4544
β-mercaptoetanolo	Tecnologie di vita	21985023