1. Considerazioni generali
- Vedere la Tabella dei Materiali/Attrezzature per un elenco dei reagenti necessari. Eseguire tutti i passaggi in condizioni rigorosamente asettiche.
- Utilizzare siero fetale bovino inattivato termicamente (hiFBS) per tutte le preparazioni di terreni che includono FBS. Per l'inattivazione termica, scaldare un'aliquota di 50 ml di FBS a 56 °C per 30 minuti, capovolgendo ogni 10 minuti (vedi anche Tabella 1).
nota: Quando FBS viene utilizzato senza inattivazione termica, il fenotipo epiteliale progredisce più rapidamente in tutte le colture di cellule SH-SY5Y.
- Prima dell'uso, lasciare che il terreno si riscaldi ed equilibri in un'incubatrice per stabilire un corretto equilibrio del pH prima di ogni passaggio. Ad esempio, 50 ml di terreno impiegano circa un'ora per equilibrarsi completamente (pH 7, 37 °C, 5% CO2).
nota: Questo protocollo utilizza una procedura di scissione in due fasi che richiede la tripsinizzazione e la riplaccatura delle cellule SH-SY5Y parzialmente differenziate. Questo è un processo stressante per queste cellule eccezionalmente fragili. Pertanto, è importante incubare le cellule nella tripsina per un periodo di tempo minimo. Ciò consentirà il distacco preferenziale dei neuroni, lasciando le cellule epiteliali ancora attaccate al piatto.
- Eseguire lentamente la triturazione delle cellule differenziate con una pipetta di plastica da 10 ml con la punta contro il fondo del tubo conico contenente le cellule. Eseguire la triturazione a bassa velocità, su e giù non più di cinque volte.
2. Scongelare e coltivare cellule di neuroblastoma SH-SY5Y indifferenziate
- Preparare i terreni di crescita di base.
- Scongelare rapidamente le cellule congelate in un bagno d'acqua a 37 °C (circa 2 minuti).
- Risospendere le cellule in 9 ml di terreno di crescita di base in una provetta conica da 15 ml, quindi centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g.
- Aspirare il surnatante facendo attenzione a non disturbare le cellule pellettate e risospendere delicatamente le cellule in 10 ml di terreno di crescita di base.
- Piastra le celle su un pallone T-25 o su una piastra da 60 mm2.
- Il giorno successivo, sostituire il terreno per rimuovere le celle morte.
3. Giorno 0: Placche di Cellule per la Differenziazione
- Vedere la Figura 1 per il programma di differenziazione.
- Sciacquare le cellule indifferenziate con 1x PBS, aspirare e quindi tripsinizzare utilizzando 1-2 ml di tripsina-EDTA riscaldata allo 0,05%.
- Quando le cellule sono in tripsina, incubare per circa 3 minuti in un'incubatrice.
- Estinguere la tripsina aggiungendo 10 ml di terreno di coltura di base, sciacquare i lati del pallone o del piatto e triturare delicatamente 1-3 volte. Trasferire il contenuto in un tubo conico da 15 ml.
- Centrifugare per 2 minuti a 1.000 x g e aspirare il fluido facendo attenzione a non disturbare il pellet.
- Risospendere il pellet in 5 ml di terreno di coltura di base e triturare 1-3 volte.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro, quindi diluire utilizzando il terreno di crescita di base a 50.000 cellule/ml.
- Piastra 2 ml di cellule per piastra da 35 mm2 per un totale di 100.000 cellule per piastra e riposiziona nell'incubatore.
4. Giorno 1: Cambia Media (Differenziazione Media #1)
- Aliquotare 50 ml di Differentiation Media #1 (vedi Tabella 2) e incubare in un bagno d'acqua a 37 °C.
- Quando il mezzo è riscaldato, lasciarlo equilibrare in un incubatore (37 °C, 5% CO2) per almeno un'ora per stabilire un corretto equilibrio del pH prima dell'uso.
- Aggiungere l'acido retinoico (RA) (vedere la tabella 1) ai terreni riscaldati ed equilibrati immediatamente prima di aggiungere i terreni ai piatti.
nota: L'acido retinoico è sensibile alla luce e deve essere conservato in bottiglie scure a 4 °C
- Aspirare delicatamente i vecchi supporti e gettarli.
- Aggiungere 2 ml di Differentiation Media #1 con AR per piastra da 35 mm2 e rimettere nell'incubatore.
5. Giorno 3: Cambia Media (Differenziazione Media #1)
- Ripetere la Sezione 4 (passaggi 1-5)
6. Giorno 5: Cambia Media (Differenziazione Media #1)
- Ripetere la Sezione 4 (passaggi 1-5)
7. Giorno 7: Celle Divise 1:1
- Aggiungere l'AR al terreno di differenziazione riscaldato ed equilibrato #1 immediatamente prima di aggiungere il terreno ai piatti.
- Aspirare delicatamente i vecchi supporti e gettarli.
- Aggiungere 200 μl di tripsina EDTA riscaldata allo 0,05% per piastra da 35 mm2 e scaldare in un incubatore per circa 2-3 minuti o fino a quando le cellule non sono visibilmente sollevate dalla piastra, come osservato al microscopio.
- Estinguere la tripsina aggiungendo 2 ml di Terreno di Differenziazione #1 con AR per piastra da 35 mm2 e utilizzare il terreno per sciacquare le cellule neuronali rimanenti dalla piastra. Quindi trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 ml.
nota: Non tripsinizzare troppe pietanze contemporaneamente durante le fasi di tripsinizzazione. Questo aiuta a garantire che le colture neuronali non vengano incubate nella tripsina per troppo tempo, che può essere citotossica.
- Unire il contenuto di un massimo di 10 piatti nella provetta conica da 50 ml e triturare delicatamente su e giù non più di cinque volte con una pipetta di plastica da 10 ml.
- Aliquotare 2 ml di sospensione cellulare in 2 piastre fresche da 35 mm e rimetterle nell'incubatore.
8. Giorno 8: Cambia Media (Differenziazione Media #2)
- Aggiungere l'AR (vedere la Tabella 1) ai fluidi riscaldati ed equilibrati immediatamente prima di aggiungere i terreni alle stoviglie.
- Aspirare delicatamente i vecchi supporti e gettarli.
- Aggiungere lentamente 2 mL di Terreno di Differenziazione #2 (vedere Tabella 2) con AR per piastra da 35 mm2 e rimettere nell'incubatore. Non lasciare che i neuroni siano esposti all'aria per un periodo prolungato poiché possono seccarsi rapidamente.
9. Giorno 9: Preparare i Piatti Rivestiti di Matrice Extracellulare (ECM)
- Scongelare una fiala di soluzione ECM con ghiaccio e diluire 1:100 in DMEM freddo.
- Erogare 2 ml di composto in ogni piatto da 35 mm2 e assicurarsi che l'intera base del piatto sia coperta.
- Mettere in un'incubatrice (37 °C, 5% CO2) per 1 ora o tutta la notte.
- Aspirare la miscela e lasciarla asciugare all'aria per circa 1 ora in una cappa. Conservare a temperatura ambiente per un massimo di 2 mesi.
10. Giorno 10: Trasferimento delle cellule su piastre rivestite ECM 1:1
- Aggiungere l'AR (vedere la Tabella 1) ai fluidi riscaldati ed equilibrati immediatamente prima di aggiungere i terreni alle stoviglie.
- Aspirare delicatamente il terreno e gettarlo.
- Aggiungere 200 μl di tripsina riscaldata a ciascuna piastra da 35 mm2 e lasciare incubare a temperatura ambiente per circa 1-2 minuti o fino a quando i neuroni non sono visibilmente sollevati dalla capsula come osservato al microscopio.
nota: Eseguire questa fase di tripsinizzazione a temperatura ambiente per evitare di sovraincubare i neuroni con la tripsina e causare danni. In questa fase, i neuroni si liberano dalle placche molto più velocemente delle cellule epiteliali.
- Estinguere la tripsina aggiungendo 2 ml di Terreno di Differenziazione #2 per piastra da 35 mm2 e utilizzare il terreno per sciacquare le cellule neuronali rimanenti dalla piastra. Quindi trasferire il contenuto in un tubo conico da 50 ml.
- Unire il contenuto di un massimo di 10 piatti nella provetta conica da 50 ml e triturare delicatamente su e giù non più di cinque volte con una pipetta di plastica da 10 ml.
- Erogare 2 ml di sospensione cellulare in piastre da 35 mm2 rivestite con ECM e rimetterle nell'incubatore.
11. Giorno 11: Cambia Media (Differenziazione Media #3)
- Aggiungere l'AR (vedere la Tabella 1) ai fluidi riscaldati ed equilibrati immediatamente prima di aggiungere i terreni alle stoviglie.
- Aspirare delicatamente i vecchi supporti e gettarli.
- Aggiungere lentamente 2 ml di Terreno di Differenziazione #3 (vedere Tabella 2) con AR per piastra da 35 mm2 e rimettere nell'incubatore. Non permettere che i neuroni siano esposti all'aria per un periodo prolungato.
12. Giorno 14: Cambia Media (Differenziazione Media #3)
- Ripetere la Sezione 11 (passaggi 1-3)
13. Giorno 17: Ultimo cambio di media (Differenziazione Media #3)
- Ripetere la Sezione 11 (passaggi 1-3)
14. Giorno 18: Colture Neuronali Pronte all'Uso
- Cambia il terreno in un nuovo Terreno di differenziazione #3 con AR ogni 3 giorni per mantenere la salute dei neuroni.
nota: Le cellule dovrebbero essere differenziate in neuroni e mostrare un fenotipo neuronale. Le colture sono in genere stabili fino a 14 giorni dopo la differenziazione terminale. Tuttavia, la durata della vitalità dei neuroni dipende dal numero di passaggi delle cellule indifferenziate all'inizio della differenziazione. Numeri di passaggio più elevati producono neuroni differenziati con una vita utile più breve.
Tabella 1: Soluzioni e componenti di serie.
| componente | Dettagli | ceppo | disposizioni |
| 10 μM RA | Acido retinoico all-trans | 5 mM | Risospendere 50 mg di AR in 33,3 ml di EtOH al 95%. L'artrite reumatoide è sensibile al calore, alla luce e all'aria. Conservare in bottiglia scura e conservare a 4 °C per un massimo di 6 settimane. Utilizzare a diluizione 1:500 e diluire in mezzi di differenziazione immediatamente prima dell'uso |
| (300,44 g/mol) |
| 1x B-27 | Supplemento B-27 | 50 volte | Scongelare il flacone da 1-10 ml e il resto dell'aliquota in aliquote monouso da 1 ml e conservare a -80°C. Conservare i flaconi da 10 ml a -20 °C |
| 20 mM KCl | cloruro di potassio | 1 M | Aggiungi 250 ml di acqua a 18.6 g di KCl e filtro sterile. Conservare a temperatura ambiente |
| (74,55 g/mol) |
| 2 mM db-cAMP | dibutirrile ciclico AMP | 1 M | Risospendere la bottiglia piena aggiungendo 2.04 ml di acqua a 1 g di db-cAMP. Sensibile alla luce e all'umidità. Conservare in aliquote da 100 μl o 200 μl a -20 °C o -80 °C |
| (491,37 g/mol) |
| 50 ng/ml di BDNF | Fattore neurotrofico derivato dal cervello (BDNF) | - | Centrifugare la fiala per portare la polvere sul fondo. Risospendere il flaconcino da 10 μg in 1 ml di Neurobasal + 1x B27 o il flaconcino da 5 μg in 0,5 ml di Neurobasal + 1x B27 per ottenere 10 μg/ml. Utilizzare in diluizione 1:200. Conservare le aliquote di lavoro a -80 °C (es: 250 μl) |
| hiFBS | Siero fetale bovino inattivato a caldo | - | Aliquot scongelato FBS in provette coniche da 50 ml. Scaldare a 56 °C a bagnomaria per 30 min. Rimuovere e congelare le aliquote di lavoro a -20 °C |
Tabella 2: Ricette multimediali.
| Terreni di Crescita di Base |
| componente | Volume per 500 ml | diluizione |
| EMEM | 415 ml di EMEM | |
| 15% hiFBS | 75 ml di hiFBS | |
| 1x penna/streptococco | 5 ml di penna/streptococco | s1:100 |
| 2 mM di glutammina | 5 ml di glutammina | s1:100 |
| *Conservare per un massimo di 6 settimane | |
| Mezzi di differenziazione #1 |
| componente | Volume per 50 ml | diluizione |
| EMEM | 48 ml di EMEM | |
| 2,5% hiFBS | 1,3 ml di hiFBS | |
| 1x penna/streptococco | 500 μl di penna/streptococco | s1:100 |
| 2 mM di glutammina | 500 μl di glutammina | s1:100 |
| 10 μM RA | 100 μl di RA (5 mM di magazzino) | s1:500 |
| *Conservare per 2 settimane al massimo e aggiungere RA immediatamente prima dell'uso |
| *Non conservare i media extra una volta aggiunto RA - RA è instabile |
| Mezzi di differenziazione #2 |
| componente | Volume per 50 ml | diluizione |
| EMEM | 49 ml di EMEM | |
| 1% hiFBS | 500 μl di hiFBS | |
| 1x penna/streptococco | 500 μl di penna/streptococco | s1:100 |
| 2 mM di glutammina | 500 μl di glutammina | s1:100 |
| 10 μM RA | 100 μl di RA (5 mM di magazzino) | s1:500 |
| *Conservare per 2 settimane al massimo e aggiungere RA immediatamente prima dell'uso |
| *Non conservare i media extra una volta aggiunto RA - RA è instabile |
| Mezzi di differenziazione #3 |
| componente | Volume per 50 ml | diluizione |
| Neurobasale | 47 ml Neurobasale | |
| 1x B-27 | 1 ml di B-27 (50X stock) | 1:50 |
| 20 mM KCl | 1 ml di KCl (1 milione di pezzi) | 1:50 |
| 1x penna/streptococco | 500 μl di penna/streptococco | s1:100 |
| 2 mM di GlutamaxI | 500 μl di GlutamaxI (100x stock) | s1:100 |
| 50 ng/ml di BDNF | 250 μl di BDNF (10 μg/ml) | s1:200 |
| 2 mM di AMP ciclico dibutirrilico (db-cAMP) | 100 μl di db-cAMP (1 milione di scorte) | s1:500 |
| 10 μM RA | 100 μl di RA (5 mM di stock) | s1:500 |
| *Conservare per 2 settimane al massimo e aggiungere RA immediatamente prima dell'uso |
| *Non conservare i media extra una volta aggiunto RA - RA è instabile |
