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1. Coltura di cellule staminali embrionali di topo
- Preparare piatti o piastre per colture cellulari rivestite di gelatina allo 0,1%.
- Aggiungere 2 mL di gelatina sterilizzata allo 0,1% (0,1% p/v in acqua) a piastre per colture cellulari da 60 mm. Scuotere delicatamente per garantire un rivestimento uniforme delle piastre di coltura cellulare.
- Mettere le piastre in un'incubatrice al 5% di CO2 a 37 °C e lasciare ricoprire per 1 ora.
- Rimuovere la soluzione di gelatina allo 0,1% prima di seminare le cellule.
nota: Dopo aver rimosso la gelatina, non è necessario asciugare o lavare i piatti rivestiti.
- Coltura di cellule staminali embrionali di topo (A2lox e 129)
- Incubare le cellule mESC (A2lox e 129) nelle piastre di coltura cellulare da 60 mm rivestite di gelatina allo 0,1% in un terreno di crescita mESC a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2, rispettivamente. Il terreno di crescita mESC è costituito per l'85% da una miscela di terreno Eagle/nutriente modificato F-12 (DMEM/F12) di Dulbecco, per il 15% da un siero di sostituzione knock-out (KSR), da 0,1 mM di β-mercaptoetanolo (2ME), da 2 mM di GlutaMAX, dall'1% di aminoacido non essenziale (NEAA), dall'1% di penicillina/streptomicina (P/S), da 1000 U/mL di fattore inibitorio della leucemia (LIF), da 10 nM di CHIR-99021 (inibitore di GSK-3) e da 0,33 nM di PD0325901 (inibitore di MEK).
ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo è infiammabile e ha tossicità per inalazione. Tenere lontano da fonti di fuoco e indossare una maschera per evitare l'inalazione durante l'uso.
- Cambia quotidianamente il mezzo di crescita mESC per una migliore crescita di A2lox e 129.
- Quando le cellule raggiungono l'80% di confluenza, rimuovere il terreno e aggiungere 1 mL di tripsina allo 0,1% al piatto. Oscillare delicatamente per 30 s per garantire una copertura uniforme della tripsina su tutte le cellule.
- Lasciare le cellule per circa 1 minuto a tripsinizzare, quindi rimuovere la tripsina utilizzando una pipetta da 1 mL.
- Aggiungere 2 mL di terreno di coltura mESC alla piastra, pipettare su e giù più volte per ottenere una sospensione a singola cellula.
- Contare la densità delle cellule nella sospensione nel modo più accurato possibile utilizzando un emocitometro.
- Dividere le cellule in 7 gruppi e indurre la differenziazione utilizzando diversi protocolli mostrati nella Tabella 1.
2. Differenziazione da mESC a NPC
- Preparare piastre per colture cellulari rivestite di gelatina allo 0,1% o vetrini coprioggetti.
- Prima dell'uso, preparare piastre o vetrini coprioggetti a 6 pozzetti rivestiti di gelatina allo 0,1% come al punto 1.1.
- Differenziazione (Tabella 1)
- Aggiungere 1,5 x 106 mESC in una capsula batterica non adesiva in 10 mL di terreno di differenziazione basale I per consentire la formazione di corpi embrioidi a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2.
- Dopo 2 giorni, trasferire gli aggregati cellulari in provette da centrifuga da 15 mL e lasciarli depositare per gravità.
- Rimuovere il surnatante e aggiungere 10 mL di terreno di differenziazione basale I fresco per risospendere i corpi embrioidi. Ripiantarli in una nuova capsula batterica non adesiva e lasciare la differenziazione per altri 2 giorni.
- Controllare la formazione dei corpi embrioidi al microscopio (Figura 1A).
- Raccogli i corpi embrioidi come descritto nei passaggi 2.2.2-2.2.3. Seminare circa 50 corpi embrioidi in 2 mL di terreno di differenziazione basale I per pozzetto su piastre a 6 pozzetti rivestite di gelatina allo 0,1%.
- Preparare 1 mM di brodo di acido retinoico (RA) all-trans (in DMSO) e conservare al riparo dalla luce in un congelatore a -80 °C dopo il sub-imballaggio.
nota: L'artrite reumatoide è instabile e occorre prestare attenzione a tenerla lontana dalla luce e a ridurre il contatto con l'aria durante la preparazione dell'artrite reumatoide.
- Per l'induzione dell'artrite reumatoide, aggiungere 2 μl di brodo per l'artrite reumatoide in ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di 1 μM.
- Posizionare la piastra nell'incubatore al 5% di CO2 a 37 °C e differenziare per altri 4 giorni.
- Sostituire tutti i 2 mL di terreno di differenziazione basale I (con 1 μM di RA) ogni 2 giorni.
Tabella 1: Dettagli del protocollo utilizzato nella differenziazione.
| protocollo | media |
| 4 giorni di formazione di corpi embrioidi + 4 giorni di induzione dell'artrite reumatoide | Mezzo di differenziazione basale:
DMEM/F12 +15%FBS + 1%NEAA+0.1mM 2ME+ 1%P/S |
