Differenziazione delle cellule progenitrici neurali in neuroni

Abstract

Fonte: Mao, X., et al. Differenziazione neuronale da cellule staminali embrionali di topo in vitro. J. Vis. Exp. (2020).

Il video ha mostrato un metodo di coltura cellulare per differenziare le cellule progenitrici neurali in neuroni. Incubando le cellule in un terreno ricco di sostanze nutritive integrato con fattori di crescita, le cellule progenitrici sono maturate in neuroni con assoni e dendriti sviluppati. Un agente stabilizzante ha assicurato la vitalità cellulare e protetto dal danno ossidativo durante tutto il processo di differenziazione.

Protocollo

1. Differenziazione da NPC a neuroni (Fase II)

1. Seminare circa 5 x 10⁵ cellule staminali embrionali di topo o derivati mESC entro 2 mL dal terreno di differenziazione basale I per pozzetto sulle piastre a 6 pozzetti rivestite di gelatina allo 0,1%. Dividi casualmente i derivati mESC in 3 gruppi, rispettivamente come protocollo 1, protocollo 2 e protocollo 3 di Fase II.
2. Posizionare la piastra nell'incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C per consentire il fissaggio per 6 ore. Lavarle due volte con 2 ml di PBS.
3. Aggiungere 2 mL di terreno di differenziazione basale I, terreno N2B27 I e terreno N2B27 II II (Tabella 1), rispettivamente, a ciascun pozzetto dei gruppi di cui sopra.
4. Metti le piastre nell'incubatrice e lasciale differenziare per altri 10 giorni. Cambiare il supporto corrispondente ogni 2 giorni.
5. Controllare lo stato di differenziazione e registrare i cambiamenti morfologici come indicato nella fase 3.
6. Il giorno 18, valutare la generazione di neuroni (β-tubulina III positiva) e determinare l'efficienza di differenziazione dei 3 protocolli utilizzati nella fase 4.

Risultati

Tabella 1: Dettagli dei 3 protocolli utilizzati nella differenziazione di fase II.

Fase di differenziazione II (10g)
	Protocolli	media
Protocollo 1	Differenziazione naturale: con il mezzo di differenziazione basale I solo	Mezz...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Anticorpo anti-β-tubulina III prodotto nel coniglio	Sigma Aldrich	T2200	conservato a -80 °C, evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti
Integratore di B-27 (50X), senza siero	Gibco	17504044	conservato a -20 °C e proteggere dalla luce
DME/F-12 1:1 (1x)	HyClone	SH30023.01B	conservato a 4 °C
Siero fetale bovino	HyClone	SH30084.03	conservato a -20 °C, evitare ripetuti congelamenti e scongelamenti
Microscopia a fluorescenza	Olimpo	CKX53
gelatina	Gibco	CM0635B	conservato a temperatura ambiente
Integratore GlutaMAX	Gibco	35050061	conservato a 4 °C
Tampone di diluizione dell'anticorpo primario con colorazione Immunol	Beyotime	P0103	conservato a 4 °C
KnockOut DMEM/F-12	Gibco	12660012	conservato a 4 °C
MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali	Gibco	11140076	conservato a 4 °C
Supplemento N-2 (100X)	Gibco	17502048	conservato a -20 °C e proteggere dalla luce
Siero di capra normale	Jackson	005-000-121	conservato a -20 °C
Terreno neurobasale	Gibco	21103049	conservato a 4 °C
Piatto batterico non adesivo	Corning	Telefono 3262
Soluzione salina tamponata con fosfato (1X)	HyClone	SH30256,01B	conservato a 4 °C
Soluzione di penicillina/streptomicina	HyClone	SV30010	conservato a 4 °C
PD0325901(Mirdametinib)	Selleck	Episodio 1036	conservato a -20 °C
Acido retinoico	sigma	Codice: R2625	conservato a -80 °C e proteggere dalla luce
Ceppo 129 Cellule staminali embrionali di topo	Ciageno	MUAES-01001	Mantenuto in un sistema di coltura senza alimentatore
2-mercaptoetanolo	Gibco	21985023	conservato a 4 °C e proteggere dalla luce
4% paraformaldeide	Beyotime	P0098	conservato a -20 °C
6 - piastra a pozzetti	Corning	3516
Piatto per coltura cellulare da 60 mm	Corning	430166
Provetta da centrifuga da 15 ml	Nunc	Codice 339650