Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Dissociazione dei gangli sensoriali
- Pipettare 500 μl di soluzione di dissociazione dei gangli (GaDS) (Tabella 1), lasciando i gangli nella provetta. Lavare i gangli una volta aggiungendo 1 ml di soluzione tampone fosfato (PBS), attendere che i gangli si depositino sul fondo della provetta, quindi pipettare il PBS.
- Aggiungere 1 ml di GaDS e 22 μl di enzima di digestione (collagenasi I/II e miscela di proteasi, 2,5 mg/ml in acqua) in ciascuna provetta.
- Aggiungere 20 μl di Fast Blue (5,26 mM) alla provetta di controllo positivo.
- Mettere i tubi in un bagnomaria o in un blocco riscaldante impostato a 37 °C.
- Ogni 15 minuti, agitare brevemente i tubi e agitarli per assicurarsi che i gangli siano coperti dalla soluzione.
nota: Il tempo di digestione dei gangli dipende dall'età dell'enzima digestivo. Entro un mese dalla dissoluzione dell'enzima della digestione, digerire per 30 minuti; Entro 2 - 6 mesi, digerire per 45 minuti. Se l'enzima ha più di sei mesi, digerire i gangli per 60 minuti.
- Durante la digestione dei gangli, preparare i gradienti di densità utilizzando una soluzione di particelle (particelle di silice colloidale rivestite con polivinilpirrolidone).
- Miscelare il 12% di soluzione di particelle in GaDS, 500 μl per campione.
- Miscelare una soluzione di particelle al 28% in GaDS, 500 μl per campione.
- Aggiungere lentamente e con attenzione 400 μl di soluzione con densità al 12% sopra 400 μl di soluzione con densità al 28% in una provetta fresca da 1,5 ml per ogni campione. Non permettere che i due strati si mescolino. Nel tubo dovrebbero essere visibili due strati distinti, uno più scuro dell'altro.
- Dopo il tempo di digestione appropriato, rimuovere il GaDS con l'enzima di digestione e lavare i gangli due volte con 1 ml di PBS. Aggiungere 200 μl di GaDS fresco a ciascuna provetta.
- Utilizzare una pipetta da 200 μl, impostata su un volume di 100 μl, e pipettare i gangli su e giù più volte per rompere le cellule. Ripetere fino a quando non si vede alcun pezzo di tessuto intatto. Evitare di creare bolle nella soluzione.
- Far passare le cellule dissociate attraverso un filtro cellulare da 70 μm.
- Aggiungere altri 100 μl di GaDS alla provetta di dissociazione originale per raccogliere le cellule vaganti rimaste e far passare la soluzione aggiuntiva attraverso il filtro cellulare. Utilizzando un nuovo puntale per pipetta, raccogliere il liquido contenente cellule rimanente che è passato attraverso il colino e si è aggrappato alla rete. Il volume finale delle cellule sospese in GaDS è di 300 μl.
- Sovrapporre con cura i 300 μl di celle sopra il gradiente di densità precedentemente realizzato. Evitare bolle e mescolamento di celle con gli strati di densità.
- Centrifugare per 10 minuti a 2.900 x g a RT.
- Una volta completata la centrifugazione, rimuovere con cautela ed eliminare lo strato superiore da 700 μl. Questo strato contiene la maggior parte dei detriti cellulari che altrimenti interferirebbero con lo smistamento cellulare.
- Aggiungere 700 μl di GaDS fresco alla cella rimanente contenente la soluzione e pipettare più volte su e giù per miscelare.
- 18. Centrifugare per 15 minuti a 2.900 x g in celle a pellet.
- 19. Una volta terminata la centrifugazione, rimuovere e scartare con cura il surnatante, lasciando il pellet della cella.
- Risospendere il pellet cellulare in GaDS da 200 - 300 μl pipettandolo su e giù con una pipetta da 1.000 μl impostata su 200 μl più volte. Metti i campioni sul ghiaccio.
Tabella 1. Miscela di reagenti per soluzione di dissociazione dei gangli (GaDS).
| ingrediente | importo |
| DMEM/f12 avanzato | Flacone da 9,5 ml |
| glutammina | 100 μl |
| HEPES (10 mM) | 100 μl |
| Integratore N2 | 100 μl |
| B27 (senza vitamina A) | 200 μl |
| NGF (50 μg/ml) | 10 μl |
