Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
NOTA: Il protocollo seguente descrive il metodo di preparazione e coltura per l'incubazione a lungo termine e l'imaging intermittente di fette di ippocampo. Una singola fetta di ippocampo viene attaccata a un vetrino coprioggetti fotoinciso appositamente preparato utilizzando un coagulo di plasma, quindi i vetrini coprioggetti vengono sigillati sul lato piatto di un tubo a rullo perforato, che viene mantenuto in un'incubatrice a rulli.
1. Preparazione della cremagliera per tubi a rulli
- Utilizzare il modello mostrato nella Figura 1A stampato alla dimensione mostrata sulla barra della scala. Con un chiodo, praticare dei piccoli fori (abbastanza grandi da contenere un pennarello a punta fine) nella sagoma centrata sui fori.
- Posizionare la dima sul fondo di una piastra per coltura tissutale da 15 cm (diametro nominale di 14 cm) e segnare la posizione dei fori. Ripeti l'operazione su un secondo piatto.
- Con punte da trapano progettate per l'uso su plastica, praticare sei fori di 1,5 cm di diametro su ciascun piatto in una matrice esagonale (4,8 cm da centro a centro) con centri dei fori a 2,5 cm dal bordo del piatto. Praticare tre fori (3 mm di diametro) a 12 mm dal bordo che siano posizionati equidistanti tra due dei fori più grandi come mostrato nella Figura 1A.
- Con il fondo di ciascuna piastra uno di fronte all'altro, posizionare una vite a macchina lunga 2,5 pollici (diametro 3/16 di pollice) con una rondella piatta attraverso uno dei piccoli fori seguita da una seconda rondella piatta, un pezzo di tubo in polietilene (distanziatore, 4,7 cm), un'altra rondella piatta, la seconda piastra di coltura tissutale, un'altra rondella piatta, una rondella di sicurezza, e un dado.
- Ripetere il passaggio 1.4 sulle altre due viti a macchina e serrare solo senza stringere fino a quando tutte le viti a macchina non sono in posizione. Quindi serrare saldamente i dadi.
- Lavorare gli anelli di tenuta (5/16 pollici di spessore, 5/8 pollici di diametro del foro) nei fori del piatto inferiore per ottenere la cremagliera finale del tubo del rullo (Figura 1B; mostrato con due tubi in posizione). Posiziona un adesivo su ogni rack con un numero univoco.
2. Preparazione dei tubi avvolgibili e dei vetrini coprioggetti
- Realizzazione della dima per praticare il foro nei tubi del rullo
- Praticare un foro di 1,5 cm profondo 8 cm nel lato centrale di un blocco di legno di 2 x 4 x 5,5 pollici con un angolo tale che il lato piatto del tubo del rullo sia quasi parallelo al blocco una volta inserito (Figura 2A).
- Ingrandire il foro utilizzando una lima di legno rotonda per allargare e assottigliare il foro per consentire l'inserimento del tubo (i tubi del rullo hanno un diametro leggermente più grande vicino all'estremità del tappo) (Figura 2B).
- Praticare un foro verticale di 1,5 cm di diametro, a 5,5 cm dal lato del blocco e centrato sul foro laterale (Figura 2C).
- Quando il foro laterale è sufficientemente affusolato, inserire un tubo del rullo contrassegnato nel punto desiderato per centrare il foro per la fetta e posizionare il tubo in modo che il punto contrassegnato sia centrato nel foro verticale di 1,5 cm.
- Rimuovere il tubo e misurare la distanza dal punto all'estremità del tubo. Segnare questa distanza dal centro del foro nella maschera e inserire un chiodo per fornire un arresto per posizionare correttamente il tubo per la perforazione (freccia nella Figura 2C).
- Usa un seghetto per tagliare l'unghia a filo con la superficie del blocco di legno per evitare lesioni.
- Aggiungere clip a molla sul fondo della maschera se è presente un trapano a colonna con fessure che ne consentono l'ancoraggio (Figura 2D freccia nera). In caso contrario, utilizzare i morsetti a C per tenere saldamente la maschera sul trapano a colonna.
- Utilizzando la dima sopra descritta per tenere e posizionare una provetta di coltura di plastica da 11 cm con il lato piatto rivolto verso l'alto (Figura 2A), praticare un foro di 6 mm di diametro con il centro a 1,0 cm dal fondo e centrato tra i lati della provetta.
nota: Dovrebbe essere utilizzata una punta da trapano progettata per la plastica.
- Con uno strumento di sbavatura girevole, levigare i bordi del foro (Figura 2E) e praticare 4 scanalature sul bordo interno del foro (Figura 2E, riquadro) per facilitare lo svuotamento del foro durante la rotazione.
- Con un perforatore da 12 mm, tagliare dischi di diametro 12 mm da fogli di gomma siliconica biadesiva atossica. Utilizzando un normale perforatore per carta monoforo (diametro 6 mm), praticare un foro al centro di ogni disco.
- Sciacquare le provette forate con etanolo al 70%, asciugarle all'aria in una cabina di sicurezza biologica e sterilizzare le provette e i dischi adesivi perforati per 40 minuti sotto la lampada a raggi ultravioletti (UV) (30 W a 70 cm di distanza media) nella cabina di sicurezza biologica.
- Riposizionare i tubi e i dischi dopo 20 minuti in modo che tutte le superfici esposte siano sterilizzate. In condizioni sterili, staccare il supporto bianco da un disco adesivo e fissare la gomma siliconica all'esterno di un tubo, allineando i fori (Figura 2F).
cautela: Per evitare l'esposizione ai raggi UV, indossare una protezione per gli occhi e chiudere l'armadio prima di accendere la lampada UV.
- Vetrini in vetro tedesco puliti fotoincisi da 12 mm di diametro (100 quadrati numerati al centro da 1 mm). Tenere delicatamente i vetrini coprioggetti con una pinza e immergerli nell'etanolo assoluto, seguito dall'acqua, seguito di nuovo dall'etanolo assoluto e infine immergere i vetrini coprioggetti in una fiamma per bruciare l'etanolo. Lasciare raffreddare i vetrini coprioggetti.
- Tenendo i vetrini coprioggetti con una pinza, immergere il 2% di 3-amminopropiltrietossisilano in acetone per 10 s. Sciacquare i vetrini coprioggetti con acqua ultrapura e lasciare asciugare all'aria.
- Posizionare i vetrini coprioggetti su carta da filtro sterile all'interno di una cabina di sicurezza biologica e accendere la luce UV. Esporre ogni lato dei vetrini coprioggetti per 20 min.
cautela: Per evitare l'esposizione ai raggi UV, indossare una protezione per gli occhi e chiudere l'armadio prima di accendere la lampada UV.
3. Preparazione della fetta di ippocampo
- Prima di iniziare la dissezione, preparare metà delle lame di rasoio a doppio taglio per il tritafazzoletti. Piegare le lame nel senso della lunghezza con cura con le dita e spezzarle a metà.
- Sciacquare le metà delle lame con acetone usando un batuffolo di cotone per pulirle, quindi risciacquare con etanolo assoluto e asciugare all'aria. Prima di montare una mezza lama sul tritatutto, sterilizzarla risciacquandola con etanolo al 70%.
- Seguire i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali; dopo l'anestesia con isoflurano, sopprimere un cucciolo di topo o ratto di 4-7 giorni mediante decapitazione e rimuovere la testa con forbici o ghigliottina><.
nota: Il protocollo di coltura della fetta di cervello è indipendente dal ceppo o dal genotipo di topo o ratto. Sono state utilizzate molte linee di topi transgenici con diversi background genetici.
- Sciacquare la testa con etanolo al 70% e metterla in una capsula Petri da 60 mm. Fino al montaggio finale della fetta di cervello sul tubo del rullo, tutti i passaggi successivi vengono eseguiti in una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità.
- Usando una lama chirurgica #21, fai un taglio sagittale attraverso la pelle e il cranio. Con una pinza Dumont #5, staccare la pelle e il cranio per esporre il cervello.
- Con la pinza chiusa, estrai delicatamente l'intero cervello, rilasciandolo pizzicando con la pinza attraverso il tronco encefalico dietro il cervelletto. Mettere il cervello in un piatto sterile da 60 mm contenente 4 °C di soluzione salina bilanciata di Gey/0,5% di glucosio (GBSS/glucosio).
- Utilizzando un microscopio da dissezione per visualizzare il cervello (Figura 3A), posizionare il lato dorsale del cervello verso l'alto e tagliare il terzo anteriore del cervello e il cervelletto con una lama chirurgica (Figura 3B).
- Con una pinza, tieni il cervello tagliato con il lato posteriore verso l'alto e il lato ventrale contro il lato della capsula di Petri per stabilità. Estrarre delicatamente le meningi attorno alla linea mediana sagittale e rimuovere il tessuto mesencefalico utilizzando una pinza Dumont #5 a punta fine (Figura 3C, cerchio tratteggiato).
- Fai due tagli lungo il lato del cervello per aprirlo (Figura 3C, linee tratteggiate). Una volta che il cervello è posizionato con il lato dorsale rivolto verso il basso e aperto, la fessura dell'ippocampo dovrebbe essere visibile (Figura 3D, freccia).
- Trasferire il cervello aperto su un pezzo di pellicola di plastica di policlorotrifluoroetilene e posizionarlo per l'affettatura sul palco di un tritatessuti. Bagnare la lama con GBSS/glucosio e tagliare l'ippocampo a fette spesse ~300 μm.
- Con una pipetta di trasferimento, sciacquare il cervello affettato dalla pellicola di plastica in un piatto fresco da 60 mm contenente GBSS/glucosio (Figura 3E). Pizzicare delicatamente e stuzzicare, con una pinza a punta fine, le meningi rimanenti e altro tessuto non ippocampale (Figura 3F) dalle fette (Figura 3G, H).
4. Fette di placcatura
- Una volta ottenute le fette, posizionare 2 μL di plasma di pollo al centro del lato fotoinciso di un vetrino coprioggetti preparato. Stendere leggermente il plasma per ottenere una macchia di 3-4 mm di diametro.
nota: Il lato fotoinciso è il lato superiore del vetrino coprioggetti se visto attraverso un microscopio di dissezione in modo tale che i numeri siano orientati correttamente.
- Trasferire 1 fetta di cervello con una spatola sterile a punta stretta (Figura 4A) nello spot plasmatico (Figura 4B). Usa una pinza chiusa per mantenere la fetta sulla punta della spatola mentre sollevi la fetta dal GBSS/glucosio.
- Toccare con la spatola la macchia di plasma sul vetrino coprioggetti e, con la pinza chiusa, spingere la fetta sul vetrino coprioggetti.
- Miscelare 2,5 μl di plasma con 2,5 μl di trombina in una provetta separata. Posizionare rapidamente 2,5 μl di questa miscela sopra e intorno alla fetta e pipettare delicatamente su e giù per mescolarla (Figura 4B).
nota: Il plasma si coagulerà entro 10-15 s, quindi questo deve essere fatto rapidamente. Se l'adesione della fetta è un problema, mescolare 5 μL di plasma con 5 μL di trombina e utilizzare 4-5 μL sulla fetta, rimuovendone un po' dopo la miscelazione in modo che la fetta sia piatta sul vetrino coprioggetti.
- Rimuovere la copertura di plastica trasparente dal lato esposto dell'adesivo in gomma siliconica precedentemente fissato a un tubo del rullo e posizionare il vetrino coprioggetti con la fetta di cervello sull'adesivo allineando la fetta all'interno del foro (Figura 4C).
- Per garantire l'adesione, applicare una pressione morbida e uniforme sul vetrino coprioggetti con il pollice premendo uniformemente il vetrino coprioggetti verso il basso e tenendolo premuto per circa 1 minuto durante il trasferimento nella cabina di sicurezza biologica.
- In una cappa di sicurezza biologica, aggiungere 0,8 mL di terreno di coltura Neurobasal A completo (Tabella dei materiali) a ciascuna provetta (Figura 4D).
- Far scorrere una miscela d'aria al 5% di CO2/95% attraverso una pipetta Pasteur sterile con tappo di cotone tenuta saldamente da una fascetta. Sciacquare la provetta del rullo con la miscela di gas e tappare rapidamente la provetta non appena viene estratta dalla pipetta.
- Etichettare le provette con il numero della fetta e il numero del rack. Inserire i tubi in una cremagliera a rulli, assicurandosi che siano geometricamente bilanciati. Se c'è un numero dispari di tubi, aggiungere tubi per bilanciare.
- Posizionare le griglie in un'incubatrice a rulli a 35 °C con rulli che ruotano la cremagliera a rulli a circa 10-13 giri all'ora (RPH) (Figura 4E). Per mantenere il fluido sul fondo dei tubi, inclinare l'incubatrice all'indietro di circa 5° sollevando la parte anteriore su una tavola.
