1. Standardizzazione delle colture neuronali utilizzando dispositivi microfluidici: assemblaggio del dispositivo
- Selezionare un dispositivo microfluidico adatto per l'esperimento desiderato. Per connettere i neuroni all'interno della stessa popolazione, utilizzare i Neuro Device (Figura 1) e per collegare i neuroni in popolazioni diverse, utilizzare i dispositivi di co-coltura (Figura 2).
- Pulire e preparare il numero desiderato di vetrini coprioggetti sterili o piatti con fondo di vetro. Per ottenere i migliori risultati su superfici in plastica, utilizzare piatti da 35 mm, su vetro, utilizzare vetrini coprioggetti da 25 mm o piatti con fondo in vetro da 35 mm. Selezionare lo spessore del vetro in base al sistema di imaging, ad esempio 0,15 mm.
- Rivestire le stoviglie o i vetrini coprioggetti con 0,5-1 mL di 100 μg/mL PDL per 2 ore o per una notte a temperatura ambiente.
nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui e ripreso il giorno successivo, se lo si desidera. Inoltre, le piastre possono essere rivestite con PDL diluito con tampone borato, poli-L-lisina (PLL), laminina o qualsiasi altra molecola di adesione cellulare.
- Lavare le stoviglie due volte con acqua (non utilizzare soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) poiché i cristalli di sale potrebbero ostruire i canali), rimuovere tutto il liquido e lasciarlo asciugare in un ambiente sterile come una cabina di biosicurezza per 5-10 minuti o fino a quando la superficie non è completamente asciutta><.
nota: Fare attenzione a garantire che i vetrini coprioggetti siano assolutamente asciutti, poiché l'eventuale liquido residuo interferirà con l'aderenza dei sistemi microfluidici.
- Posizionare i dispositivi microfluidici con i modelli rivolti verso l'alto sotto la luce UV in un ambiente sterile (cappa di biosicurezza) per 10 minuti. Assicurarsi di seguire le procedure sterili quando si lavora nella cabina di biosicurezza10.
- Usando una pinzetta, posizionare un dispositivo microfluidico con un motivo rivolto verso il basso a contatto con il vetrino coprioggetti/piatto pulito. Utilizzare le pinzette per premere delicatamente il dispositivo in modo che aderisca al vetro.
nota: La trasparenza della regione aderente sarà visibile guardando in controluce. Assicurarsi che tutti gli angoli siano a contatto con il vetro. Eseguire questa operazione su tutti i dispositivi microfluidici. Vedere la Figura 1a.
- Per riempire il dispositivo a singola popolazione con il terreno, puntare la pipetta verso i canali e aggiungere 50 μL di terreno cellulare completo integrato con B-27 privo di siero (rapporto di volume 1:50) e 500 μg/mL di penicillina/streptomicina/glutammina (collettivamente chiamati NBM) al pozzetto superiore destro, quindi aggiungere altri 50 μL al pozzetto che si trova diagonalmente ad esso. Fallo per tutti i dispositivi, assicurandoti che il fluido scorra tra i pozzetti. Quindi, aggiungere 50 μl di terreno ai due pozzetti rimanenti. Vedere la Figura 3a.
- Per riempire il dispositivo a popolazione multipla con il terreno, puntare la pipetta verso i canali e aggiungere 30 μl di NBM completo ai pozzetti giusti, fare riferimento alla Figura 2a. Fallo per tutti i dispositivi, assicurandoti che il fluido scorra tra i pozzetti. Quindi, aggiungere 50 μl di terreno ai quattro pozzetti rimanenti.
- Posizionare i dispositivi in una piastra più grande con un piatto aperto con acqua autoclavata (camera umida) e metterli nell'incubatore (37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità) per 1-2 ore durante la preparazione della coltura cellulare. Vedere la Figura 3b.
2. Placcare i Neuroni nei Sistemi Microfluidici
- Seguendo un protocollo, ottenere neuroni ippocampali o corticali dissociati da embrioni di ratto Sprague Dawley (entrambi i sessi).
- Risospendere i neuroni embrionali in NBM a una concentrazione di 1-2 milioni di neuroni/mL. Verificare le concentrazioni cellulari al microscopio utilizzando un emocitometro e seguendo il riferimento8. Regolare la concentrazione cellulare in base alla densità cellulare desiderata. Per aumentare le possibilità di ottenere singoli assoni ippocampali per canale, piastra 10.000 neuroni per dispositivo. Per avere più assoni nello stesso canale, piastra 60.000 neuroni per dispositivo.
Nota: questi numeri variano a seconda del tipo di neurone utilizzato.
- Rimuovere il fluido dai dispositivi microfluidici senza svuotare i pozzetti. Lasciare circa 5 μl in ciascuno.
- Per piastrare le cellule nel dispositivo a popolazione singola, aggiungere 50 μL di NBM al pozzetto in basso a destra. A questo punto, il fluido scorre da solo per riempire l'altro pozzo inferiore. Aggiungere 20 μl della soluzione della cella concentrata nel pozzetto superiore destro del dispositivo microfluidico, come indicato nella Figura 1b.
- Per piastrare, aggiungere 20 μL della soluzione di cellule concentrate in ciascuno dei pozzetti giusti nella Figura 2a.
- Controllare al microscopio se le cellule sono all'interno delle camere e posizionare i dispositivi nell'incubatore per 15-30 minuti per favorire l'adesione delle cellule al substrato.
- Controllare al microscopio se ci sono abbastanza cellule nelle camere. Se ne servono di più, ripetere i passaggi 2.4 e 2.5.
- Aggiungere 50 μL di NBM ai 2 pozzetti superiori del dispositivo a popolazione singola e 20 μL di NBM nello stesso pozzetto in cui le cellule sono state iniettate nel dispositivo a popolazione multipla. Il terreno sporge leggermente per formare un menisco positivo, conferendo ai pozzetti un aspetto superiore di muffin. Anche in questo caso, vedere la Figura 3a.
- Mantenere le celle a 37 °C, 5% di CO2 e 95% di umidità.
3. Mantenere le Culture Neuronali
- Rimuovere l'NBM (circa 30 μl con una pipetta) dalle cellule e applicare il nuovo NBM preriscaldato il giorno successivo alla loro introduzione nei dispositivi (cioè 1 giorno dopo il passaggio 2).
- Controlla ogni 2 giorni se c'è abbastanza mezzo in ogni canale. Se la parte superiore dei muffin è bassa, basta aggiungere altro mezzo ai pozzetti superiori.
- Colture di cellule per almeno 7 giorni prima della rimozione dei dispositivi microfluidici. Le cellule possono sopravvivere in questi dispositivi per diverse settimane. Rimuovere i dispositivi 1-2 giorni prima dell'esecuzione degli esperimenti sui campioni.
4. Rimozione di dispositivi microfluidici
- 1 - 2 giorni prima di rimuovere i dispositivi microfluidici, aggiungere 2 mL di NBM preriscaldato a 37 °C a ciascun piatto di campionamento, allagando le camere, e mantenere i dispositivi nell'incubatore.
- Utilizzare una pinzetta sterile e una punta per rimuovere i dispositivi microfluidici dai vetrini coprioggetti, lasciando una configurazione modellata di neuroni. Usa la punta per tenere in posizione il vetrino coprioggetti e le pinzette per agganciare il bordo del dispositivo nell'angolo in basso a sinistra del pozzo. Applicare delicatamente la torsione, sollevando il dispositivo con le pinzette in modo che si stacchi dal vetrino coprioggetti. Vedere la Figura 3c-3d.
- Ogni 2-3 giorni, sostituire metà dell'NBM fino a quando il campione non viene utilizzato per gli esperimenti.
- Prima di eseguire esperimenti di ricablaggio sul campione, verificare che i neuriti nei canali del dispositivo a popolazione singola e le popolazioni neuronali nel dispositivo a popolazione multipla siano isolati esaminando gli spazi tra di loro al microscopio per assicurarsi che non vi siano filamenti che collegano le popolazioni neuronali.
5. Preparazione di perline rivestite con PDL
- Aggiungere 2 gocce da 50 μl di perle di polistirene da 4, 10 o 20 μm diluite in acqua (1:500) a 1 mL di PDL (100 μg/mL). Lasciare agire per almeno 2 ore a temperatura ambiente.
NOTA: Il protocollo può essere messo in pausa qui e ripreso il giorno successivo.
- Centrifugare la soluzione a 8,820 x g per 1 minuto. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare le perle accumulate sul fondo del contenitore.
- Lavare le perle due volte con 1 mL di soluzione sterile 10 mM HEPES pH 8.4.
- Risospendere le perle rivestite di PDL in 200 mL di soluzione HEPES pH 8.4 da 10 mM.
6. Preparazione delle micropipette
- Preparare le pipette da provette capillari di vetro (diametro interno 1 mm, diametro esterno 1,5 mm) utilizzando un estrattore di elettrodi orizzontale. Regolare le impostazioni in modo che la punta esterna della micropipetta estratta sia ~ 2-5 μm. Prima di tirare, assicurarsi che i tubi di vetro siano puliti.
- Fissare le pipette ai vetrini per la conservazione e assicurarsi che il puntale non entri in contatto con la superficie del vetrino poiché il puntale è fragile. Conservare a temperatura ambiente in un contenitore coperto per proteggerlo dalla polvere. Utilizzare le pipette lo stesso giorno in cui vengono estratte.
7. Adesione delle perline PDL ai neuroni
- Aggiungere 40-60 μl di perle rivestite di PDL preparate nella fase 5 a una coltura cellulare preparata nella fase 4. Centrare la punta della pipetta sui neuroni, che sono debolmente visibili sul vetrino coprioggetti, e aggiungere le perline (vedere la Figura 4).
- Rimettere il campione nell'incubatrice per 1 ora per favorire la formazione di contatti sinaptici.
- Dopo l'incubazione, rimuovere eventuali perle non aderenti lavando delicatamente la coltura con NBM preriscaldato.
8. Preparazione di una soluzione salina fisiologica (per esperimenti a temperatura ambiente)
- Preparare una soluzione salina fisiologica. Questo serve a regolare l'ambiente cellulare al di fuori dell'incubatore.
- Verificare l'osmolarità e i livelli di pH.
- Infondere continuamente la soluzione con O2 per ridurre al minimo le fluttuazioni del pH durante l'esecuzione degli esperimenti.
- Riscaldare a temperatura ambiente.
- Impostare il sistema di perfusione inserendo un'estremità di un tubo di plastica (dimensioni opzionali) in una soluzione fisiologica infusa di O2 e fissando l'altra estremità a un ago inserito nel portacampioni. Posizionare il tubo e la soluzione più in alto del campione (vedere la Figura 5).
- Scollegare il tubo dall'ago e collegarlo a una siringa. Utilizzare la siringa per esercitare pressione e aspirare il liquido, riempiendo il tubo. Sigillare con un morsetto a rullo e ricollegare l'ago.
9. Micromanipolazione delle perline
- Installare il campione in una configurazione sperimentale in modo tale che le cellule possano essere accessibili dall'alto tramite due micropipette montate in micromanipolatori e accessibili otticamente dal basso, ad esempio con l'obiettivo di fase 40X (apertura numerica di 0,6) di un microscopio ottico invertito. In questa configurazione, montare una telecamera CCD per l'acquisizione delle immagini sulla porta laterale del microscopio. Collegare ciascuna pipetta a siringhe da 1 ml tramite un tubo di plastica. A questo punto, sostituire NBM con una soluzione salina fisiologica (1-2 mL) (vedere Figura 5).
- Durante gli esperimenti, le cellule sono state continuamente perfuse con la soluzione salina fisiologica preparata nella fase 8 a una velocità di 0,5-1 mL/min.
- Selezionare un bead PDL NON attaccato a un neurone nel campo visivo. Allineare il cordone con la punta di una micropipetta concentrandosi sul perlina e poi fino alla micropipetta. Portare la punta il più vicino possibile al cordone monitorandola attraverso il microscopio.
- Applicare una pressione negativa con la siringa da 1 ml collegata alla pipetta per prelevare il tallone. Mantenere la pressione negativa per tutta la durata dell'esperimento.
10. Estrazione dei neuriti
- Selezionare una perlina PDL attaccata a un neurone nel campo visivo e collegarla alla seconda micropipetta utilizzando l'aspirazione come descritto nei passaggi 9.3-9.4.
- Tirare lentamente il complesso PDL-bead-neurone (~0,5 μm/min), spostando il micromanipolatore o lo stadio del campione di 1 μm e facendo una pausa di 5 minuti per consentire l'inizio del neurite.
- Ripetere il passaggio 10.2 due volte.
Nota: i primi 3 μm devono essere tirati molto lentamente per garantire il successo dell'esperimento, che si verifica oltre il 95% delle volte.
- Estrarre il complesso PDL-perlina-neurone muovendo lentamente (~0,5 μm/min) il micromanipolatore o lo stadio del campione di 2 μm e fare una pausa di 5 minuti per consentire l'allungamento dei neuriti.
- Dopo l'inizio riuscito e l'estensione del neurite per i primi 5 μm, tirare il neurite a 20 μm/min su distanze millimetriche.
NOTA: La trazione può essere eseguita in modo continuo o graduale e a velocità variabili. Vedere la Figura 6b-6c.
11. Collegare i Neuroni
- Seleziona una regione ricca di neuriti e abbassa il complesso PDL-bead-neurite in modo che entri fisicamente in contatto con essa. Utilizzare altre perline per misurare l'altezza della punta sopra la superficie del vetrino coprioggetti. Vedere la Figura 6d.
- Lasciare il complesso PDL-bead-neurite a contatto con il neurite bersaglio mentre si manipola la seconda micropipetta. Abbassare la seconda pipetta con la seconda perlina PDL sopra il neurite appena formato a circa 20 μm dalla prima perlina. Utilizzare la seconda perlina PDL per spingere il nuovo filamento di neurite verso la cellula bersaglio.
- Tenere entrambe le perle in posizione per almeno 1 ora. Verificare al microscopio l'assenza di rigonfiamento focale, un ispessimento dei neuriti a contatto con la perlina16.
- Durante questo periodo, utilizzare la perfusione per cambiare lentamente il mezzo del campione da soluzione fisiologica a NBM preriscaldato e bilanciato con CO2.
- Rilasciare il cordone dalla seconda pipetta rilasciando l'aspirazione. Se il nuovo neurite rimane attaccato, rilascia anche la prima perlina. Vedere la Figura 6e .
- Rimuovere delicatamente la soluzione salina e sostituirla con NBM (~2 mL).
- Riposizionare con cura il campione nell'incubatrice per rafforzare la connessione neuronale per esperimenti futuri. Questa connessione è stabile per >24
