Generazione di neuroni riprogrammando le cellule dei fibroblasti dermici umani

Abstract

Fonte: Shrigley, S., et al. Generazione semplice di una coltura ad alto rendimento di neuroni indotti da fibroblasti cutanei adulti umani. J. Vis. Exp. (2018)

Il video dimostra la generazione di neuroni da fibroblasti dermici umani adulti (aHDF). Gli aHDF vengono riprogrammati utilizzando un vettore lentivirale che trasporta geni per fattori di trascrizione neuronale e RNA a forcina corta (shRNA). Gli shRNA inibiscono l'espressione di un repressore trascrizionale neuronale e i fattori di trascrizione neuronale attivano i geni per differenziare gli aHDF in neuroni. Questi aHDF riprogrammati vengono coltivati in un mezzo di conversione neuronale precoce e tardiva per generare neuroni maturi.

Protocollo

1. Preparazione dei fibroblasti cutanei per la riprogrammazione

1. Utilizzando un sistema automatizzato di scongelamento cellulare o un bagno d'acqua a 37 °C, scongelare i fibroblasti dermici umani adulti (aHDF) e la piastra 200.000 per matraccio T75 (contare con un contatore di cellule automatizzato) in 10 mL di terreno per fibroblasti (vedere Tabella 1) a 37 °C in CO₂ al 5%.
2. Eseguire un cambio completo del terreno con il terreno fibroblastico il giorno successivo.
3. Cambiare il terreno dei fibroblasti ogni 3-4 giorni fino a quando le cellule raggiungono il 95% di confluenza.
   nota: Un pallone confluente conterrà circa 1.000.000 di cellule.

2. Placcatura per la riprogrammazione (Giorno -1)

NOTA: Si consiglia di utilizzare un rivestimento di gelatina per esperimenti a breve termine (fino a 30 giorni); in alternativa, per esperimenti a lungo termine si consiglia di iniziare con un rivestimento in poli-L-ornitina, fibronectina e laminina (PFL).

1. 60 minuti prima di placcare gli aHDF per la riprogrammazione, rivestire una piastra a 24 pozzetti con gelatina allo 0,1% (250 μL/pozzetto) e incubare a 37 °C.
2. Aspirare il terreno fibroblastico sugli aHDF. Lavare una volta con soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS). Dissociare le cellule con tripsina allo 0,05% (1,5 mL per matraccio T75) a 37 °C per 3-5 minuti.
3. Aggiungere un terreno fibroblastico per neutralizzare la tripsina (3 mL per getto per matraccio T75) e raccogliere le cellule staccate in una provetta da 15 mL risciacquando due volte le cellule nel pallone.
4. Centrifugare le cellule a 400 x g per 5 minuti. Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di terreno per fibroblasti.
5. Contare le cellule utilizzando un contatore di cellule automatizzato (per garantire una conversione di buona qualità, verificare che la vitalità delle cellule sia superiore al 90% con colorazione blu di tripano).
6. Per una piastra completa da 24 pozzetti, preparare una sospensione di 1.320.000 cellule in 13,2 mL di terreno per fibroblasti per ottenere una sospensione di 100.000 cellule/mL di terreno (o 55.000 cellule/pozzetto in 550 μL di terreno per fibroblasti moltiplicato per il numero di pozzetti necessari).
7. Aspirare la gelatina dal piatto e lavare due volte con DPBS. Aggiungere 500 μl della sospensione cellulare a ciascun pozzetto e incubare per una notte a 37 °C in CO₂ al 5%.

3. Trasduzione virale (giorno 0)

NOTA: Lavorare con particelle lentivirali richiede attrezzature di categoria 2 e l'uso di un agente per neutralizzare il virus. Si consiglia inoltre vivamente di indossare doppie paia di guanti.

1. Riscaldare 13,2 mL di terreno fibroblastico a 37 °C.
2. Scongelare un vettore lentivirale contenente i fattori di trascrizione della famiglia achete-scute, il fattore di trascrizione bHLH 1 (Ascl1) e Brn2 con due RNA a forcina corta (shRNA) che hanno come bersaglio il fattore di trascrizione di silenziamento RE1 (REST) a temperatura ambiente.
3. Aggiungere il volume necessario di lentivirus per infettare gli aHDF con una molteplicità di infezione (MOI) di 20 al terreno senza alcun potenziatore di trasduzione.
   
4. Sostituire il terreno nella piastra a 24 pozzetti con un terreno per fibroblasti contenente il vettore lentivirale (500 μL/pozzetto) e incubare per una notte a 37 °C in CO₂ al 5%.
5. Il giorno successivo, sostituire il terreno nei pozzetti con un terreno di fibroblasti fresco senza il vettore lentivirale.
   nota: Il terreno è considerato infettivo per 7 giorni e, pertanto, devono essere utilizzate adeguate procedure di protezione e manipolazione durante la prima settimana successiva alla trasduzione virale.

4. Manutenzione delle celle di conversione

NOTA: Una volta iniziata la conversione, le cellule sono suscettibili al sollevamento; fare attenzione a ribaltare la piastra verso l'alto e utilizzare una pipetta da 1.000 μL quando si rimuove il terreno per evitare che le cellule si stacchino.

1. Il giorno 3, rimuovere il terreno fibroblastico e aggiungere 500 μL di terreno di conversione neuronale precoce (vedi Tabella 1).
2. Due o tre volte alla settimana, prelevare 225 μL di terreno vecchio dal pozzetto e aggiungere 250 μL di terreno di conversione neuronale precoce fresco.
3. Il giorno 18, rimuovere tutto il terreno da ciascun pozzetto e sostituirlo con 500 μL di terreno di conversione neuronale tardiva (vedere Tabella 1).
4. Continuare a cambiare metà del terreno come sopra con un mezzo di conversione neuronale tardiva ogni 2-3 giorni fino al giorno 25 o al punto finale dell'esperimento (Figura 1A).

Tabella 1. Composizione dei diversi mezzi utilizzati. Descrizione completa della composizione dei terreni necessari in questo protocollo, incluso il terreno dei fibroblasti, il mezzo di conversione neuronale precoce, il mezzo di conversione neuronale tardiva.

	Concentrazione delle azioni	Concentrazione lavorativa
Terreno per fibroblasti
Medio basale	N/A	N/A
Penicillina/Streptomicina	10.000 U/mL	100 mg/mL
FBS	N/A	10%
Mezzo di conversione neuronale precoce (ENM)
Mezzo di differenziazione neurale	N/A	N/A
Penicillina/Streptomicina	10.000 U/mL	100 mg/mL
CHIR99021	10 mM	2 μM
SB-431542	20 mM	10 μM
zucca	100 μg/mL	0,5 μg/mL
LDN-1931189	10 mM	0,5 μM
AVP	1 M	1 mM
Pannello LM-22A4	20 mM	2 μM
GDNF	20 μg/mL	2 ng/mL
NT3	10 μg/mL	10 ng/μl
db-cAMP	50 mM	0,5 mM
Mezzo di conversione neuronale tardiva (LNM)
Mezzo di differenziazione neurale	N/A	N/A
Penicillina/Streptomicina	10.000 U/mL	100 mg/mL
Pannello LM-22A4	20 mM	2 μM
GDNF	20 μg/mL	2 ng/mL
NT3	10 μg/mL	10 ng/μl
db-cAMP	50 mM	0,5 mM

Risultati

Figura 1: Evoluzione della conversione iN nel tempo.(A) Cronologia dell'esperimento e mappa del costrutto confezionato in un lentivirus utilizzato per riprogrammare i fibroblasti dermici umani adulti. Ogni freccia nera rappresenta un cambiamento medio. (B) Immagini rappresentative a contrasto di fase che raffigurano i cambiamenti nella morfologia delle cellule durant...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Linee cellulari
Fibroblasti dermici umani adulti			[C2 passaggio #7] La donatrice era una donna di 67 anni. Cellule ottenute dalle cliniche per la ricerca sulla malattia di Parkinson e sulla malattia di Huntington presso il John van Geest Centre for Brain Repair (Cambridge, Regno Unito).
Reagenti per coltura, trasduzione e conversione di fibroblasti
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbco (DPBS) [-CaCl2, -MgCl2]	Gibco	14190094
Tripsina-EDTA [0,5%]	Gibco	Codice 15400-054	Diluire allo 0,05% in DPBS.
Virkon (agente usato per neutralizzare il virus)	Viroderm	Codice: 7511	Diluire all'1% della soluzione con acqua tiepida.
Milli-Q Acqua	Millipore
Medio basale - Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) + GlutaMax	Gibco	61965059
Penicillina/Streptomicina [10.000 U/mL]	Gibco	Codice: 15140-122
Siero fetale bovino (FBS)	Gibco	Codice 10270-106
CryoMACS® dimetilsolfossido (DMSO) 10	Miltenyi	170-076-303
Mezzo di differenziazione neurale - NDiff 227	Takara-Clontech	Y40002
Pannello LM-22A4	Tocris	4607	Diluire 10 mg in 1450 μL di DMSO. Concentrazione del grezzo: 20 mM.
Fattore neurotrofico derivato da linea cellulare gliale (GDNF) [umano ricombinante]	Sistemi di ricerca e sviluppo	212-GD-010	Diluire 10 ug in 500 μL 0,1% BSA in DPBS. Concentrazione di base: 20 μg/mL.
NT3 [umano ricombinante]	Sistemi di ricerca e sviluppo	Codice 267-N3-025	Diluire 25 μg in 2,5 mL 0,1% BSA in DPBS. Concentrazione del magazzino: 10 μg/mL.
db-cAMP	Sigma Aldrich	D0627	Diluire 1 g in 40,7 mL di acqua Milli-Q. Filtrare e preparare aliquote da 500 μL o provette stock da 10 mL. Concentrazione del grezzo: 50 mM.
CHIR99021	assone	Anno 1386	Diluire 2 μg in 429,8 μL di DMSO. Concentrazione del grezzo: 10 mM.
LDN-193189	assone	Anno 1509	Diluire 2 mg in 360 μL di DMSO. Concentrazione del grezzo: 10 mM.
Sale sodico dell'acido valproico (VPA)	Merck Millipore	Codice 676380	Diluire 5 g in acqua Milli-Q per ottenere una concentrazione madre di 1 M. ATTENZIONE: Evitare l'ingestione, il contatto con la pelle e la formazione di polvere respirabile.
Reagenti per rivestimenti
gelatina	Sigma Aldrich	G2500	Diluire allo 0,1% in acqua Milli-Q.
Poli-L-ornitina	Sigma Aldrich	P3655	Sciogliere in acqua Milli-Q. Utilizzare a 15μg/mL.
Fibronectina	ThermoFisher Scientifico	Codice 33010-018	2 mL di acqua Milli-Q + 70 μL 0,25 M NaOH. Utilizzare a 5 μg/mL.
Laminina	ThermoFisher Scientifico	Codice 23017-015	Conservare a -80°C. Scongelare con ghiaccio, conservare in fresco e aliquotare 30 μL. Utilizzare a 5 μg/mL.
attrezzatura
Pallone T75 [Superficie Nunclon Delta]	ThermoFisher Scientifico	156499
Piastra a 24 pozzetti [Nunc]	ThermoFisher Scientifico	142485
Provetta in polipropilene da 1,5 mL	Sigma Aldrich	Z336769
Provetta Falcon da 15 mL	Sarstedt	6,25,54,502
Provetta Falcon da 50 mL	Sarstedt	6,25,47,254
Controllore Pippette			Per il pipettaggio di volumi da 1 a 25 mL.
Pipette sierologiche sterili: 5, 10 e 25 mL	Sarstedt	86.1253.001, 86.1254.001, 86.1685.001
Pipettatori a volume regolabile: 5, 20, 200 e 1.000 μl
Puntali per pipette sterili			Per volumi di pipettaggio da 0,5 a 1.000 μl.
Sistema automatizzato di scongelamento delle celle ThawSTAR	BioCisione	BCS-601
Contacellule automatizzato Countess II	ThermoFisher Scientifico	AMQAX1000
Camere di conteggio delle cellule [50 vetrini] e blu di tripano [0,4%]	ThermoFisher Scientifico	Codice: C10228	Da utilizzare con il contatore di celle automatizzato Countess II.
Cappa a flusso laminare
Incubatore umidificato al 5% CO2 37 °C
centrifuga			Adatto per provette da 1,5, 15 e 50 mL.
Agitatore orbitale
Microscopio a fluorescenza invertito	Leica	DMI6000 B