Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione pre-affettatura
- Preparare i terreni di "processamento tissutale" e i terreni di "mantenimento della coltura a fette" il giorno prima della resezione tumorale pianificata e della raccolta dei tessuti (oppure utilizzare i terreni precedentemente generati entro 2 settimane). Aggiungere 5 mL di soluzione di penicillina-streptomicina (10.000 U/mL) e 5 mL di acido 1 M 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonico (HEPES) a 500 mL di un terreno Eagle modificato di Dulbecco ad alto contenuto di glucosio (DMEM) per generare il terreno di lavorazione dei tessuti.
- Preparare 250 mL di terreno di mantenimento della coltura di fette utilizzando una base di terreno neuronale (ad es. Neurobasal) senza rosso fenolo. Integrare questo terreno con 10 mM di HEPES, 1x integratore di B-27, 400 μM di L-glutammina, 600 μM di L-alanil-L-glutammina dipeptide, 60 U/mL di penicillina, 60 μg/mL di streptomicina e 6 U/mL di nistatina.
- Conservare tutti i terreni a 4 °C per non più di 2 settimane.
2. Giorno dell'intervento: acquisizione del tessuto
- Il giorno dell'acquisizione del tessuto, preparare 50 - 100 mL di soluzioni all'1% e al 2% (wt/vol %) di agarosio a bassa temperatura di fusione in terreni di lavorazione tissutale utilizzando vetreria autoclavata e tecnica sterile in una cappa a flusso laminare. Entrambe le concentrazioni di agarosio sono necessarie per adattarsi a variazioni imprevedibili nella consistenza del tessuto tumorale.
- Riscaldare la sospensione di agarosio, utilizzando un forno a microonde, fino a quando non si osserva una leggera ebollizione. Porre la soluzione di agarosio in un bagnomaria a 37 °C per mantenerla allo stato liquido fino al momento dell'uso.
- Mettere 1 mL di terreno di mantenimento della coltura a fette in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti.
- Utilizzare una pinza sterile per posizionare inserti di coltura vuoti in politetrafluoroetilene (PTFE) in ciascun pozzetto. Collocare la piastra in un incubatore per colture tissutali umidificato, con camicia d'acqua, con un'atmosfera di CO2 al 5% mantenuta a 37 °C.
- Utilizzando una pipetta Pasteur sterile in una cappa a flusso laminare, far bollire una miscela di gas 95% O2/5% CO2 in un pallone contenente terreni di lavorazione dei tessuti ghiacciati per circa 15-30 minuti, prima dell'acquisizione del tessuto tumorale. L'uso di terreni sovraossigenati riduce al minimo l'ipossia nel tessuto durante la lavorazione.
- Preparare provette coniche da 50 mL etichettate (sufficienti per il numero desiderato di singole regioni tumorali da isolare) contenenti aliquote da 20 mL di terreno di lavorazione a freddo ghiacciato sovraossigenato per trasportare il tessuto tra la sala operatoria e l'impianto di affettamento.
- In collaborazione con un neurochirurgo, pianificare prima dell'intervento la regione tumorale per l'acquisizione del campione. Selezionare una regione tumorale con aumento del contrasto, come dimostrato dall'imaging clinico del paziente (sequenze di risonanza magnetica (MRI) post-gadolinio T1). L'esperienza precedente suggerisce che quest'area produce tessuto tumorale vitale rispetto al tessuto necrotico><.
nota: Si è tentata la generazione di fette dalla sostanza bianca circostante (peritumorale); Tuttavia, l'autofluorescenza di fondo e la diminuzione della densità delle cellule tumorali hanno limitato l'utilità sperimentale di queste fette.
- Ottenere il tessuto tumorale verso l'inizio della resezione del tumore. Evitare la raccolta di tessuto tumorale esposto a un'estesa cauterizzazione bipolare, che può compromettere la vitalità dei tessuti secondaria a lesioni termiche. I campioni di tessuto acquisiti durante la resezione tumorale frammentaria dimostrano una maggiore vitalità rispetto al tessuto acquisito da lunghe resezioni in blocco. Questa osservazione può riguardare la privazione differenziale del flusso sanguigno del tessuto tumorale a seguito della resezione chirurgica e del tempo prolungato per l'acquisizione.
- Se lo si desidera, etichettare e conservare il tessuto tumorale in provette coniche separate per isolare i campioni da regioni tumorali distinte. (cioè tessuto tumorale superficiale vs. profondo). Le posizioni precise dei tessuti possono essere registrate se/quando è disponibile la navigazione chirurgica intraoperatoria.
3. Preparazione della Cultura Slice
- Posizionare i pezzi di tessuto tumorale in una capsula di Petri con mezzi di lavorazione ghiacciati. Per lavare il tessuto tumorale e ridurre al minimo i globuli rossi aderenti, utilizzare una pipetta per sostituire delicatamente e scartare il terreno nella piastra di Petri tre volte.
- Usando un bisturi, taglia i pezzi di tumore in forme di scatola rettangolari. Tagliare i pezzi di tessuto a circa 3 mm x 3 mm x 10 mm. Rimuovere con cautela tutti i vasi attaccati attraverso l'escissione o una trazione delicata con una pinza fine.
- Pipettare 5 - 7 mL di agarosio a 37 °C in un piccolo stampo da inclusione in plastica a forma di cubo (~ 2 cm3). Verificare che la temperatura della soluzione di agarosio non sia superiore a 37 °C con un termometro sterile prima dell'uso.
- Lasciare riposare l'agarosio per circa 1 minuto su un letto di ghiaccio.
- Posizionare 2 - 4 "strisce" di tessuto tumorale nell'agarosio con l'asse lungo orientato verticalmente. nota: Le strisce di tessuto tenderanno ad "affondare" nell'agarosio prima della solidificazione. Per evitare questa complicanza, tenere temporaneamente la striscia di tessuto in orientamento verticale fino a quando l'agarosio non si è ulteriormente solidificato.
- Conservare il tessuto contenente la muffa di agarosio su un letto di ghiaccio per 2 - 5 minuti per facilitare la solidificazione.
- Togliete lo stampo dal ghiaccio e rimuovete delicatamente il blocco di agarosio tagliando i lati della forma con un bisturi. Evitare di esercitare una forza eccessiva sul blocco, che potrebbe fratturare l'agarosio.
- Utilizzare una generosa goccia di colla cianoacrilica per fissare il blocco di agarosio alla piastra del campione del vibratomo. Lasciare solidificare la colla per circa 1 - 2 minuti.
- Riempire il serbatoio del vibratomo con un mezzo di lavorazione ghiacciato per immergere il blocco di agarosio fissato alla piastra del campione.
- Durante l'affettatura, far bollire la miscela di gas 95% O2 / 5% CO2 nel serbatoio del vibratomo attraverso una pipetta di plastica sterile tagliata.
- Impostare lo spessore della fetta del vibratomo su 300 - 350 μm.
- Regolare la velocità di avanzamento della lama e l'ampiezza della lama in base alla consistenza del tessuto. Il tessuto di glioblastoma "più rigido" richiede velocità di avanzamento della lama più lente e un'ampiezza maggiore. Le impostazioni esatte della velocità e dell'ampiezza della lama variano in base alle specifiche del vibratomo.
nota: Diversi problemi sorgono comunemente durante l'affettamento. Se la striscia di tessuto si stacca dal blocco di agarosio, provare a incorporare il tessuto in un agarosio a concentrazione più elevata. Se le fette tumorali sono più spesse del desiderato (impostazione della macchina) o sono asimmetriche, aumentare l'ampiezza e diminuire la velocità della lama del vibratomo. Per garantire che il tessuto tumorale non sia attaccato o "trascinato" dal portalama, durante l'affettatura, posizionare con cura la microspatola tra il portalama e la fetta, mentre la lama si muove.
- Trasferire le fette di tessuto nella piastra di Petri con un mezzo di lavorazione ghiacciato utilizzando una microspatola in acciaio inossidabile.
- Ottenere dall'incubatore piastre a 6 pozzetti contenenti inserti in PTFE e terreni di coltura a fette equilibrati (come preparato nella sezione 2, fase 4).
- Piastra le fette di tessuto utilizzando una microspatola in acciaio inossidabile. Ridurre al minimo il contatto diretto e la manipolazione del tessuto utilizzando un pennello a setole sottili per generare una "onda fluida" per spingere delicatamente la fetta fuori dalla spatola e sull'inserto di coltura.
nota: Ridurre al minimo la quantità di terreno di lavorazione introdotto sopra l'inserto di coltura tissutale. Se vengono trasferite quantità eccessive di terreno che fanno galleggiare le fette, utilizzare una pipetta Pasteur sterile per rimuovere il terreno.
- Riportare le piastre a 6 pozzetti contenenti fette tumorali in un incubatore mantenuto a 37 °C con un'atmosfera di CO2 al 5%.
nota: L'intero protocollo di inclusione e affettatura deve essere completato entro 90 minuti dall'acquisizione del tessuto tumorale dalla sala operatoria.
4. Manutenzione della Cultura delle Sezioni
- Dopo 12 - 24 ore, trasferire le colture di fette afferrando ciascun bordo dell'inserto con una pinza sterile e trasferirle su piastre contenenti terreni di mantenimento della coltura di fette fresche. Assicurarsi che il terreno di mantenimento della coltura a fette aliquotato in ciascun pozzetto si equilibri nell'incubatore per almeno 15 minuti prima di trasferire gli inserti.
- Spostare gli inserti nelle nuove piastre a 6 pozzetti con terreni di coltura a fette freschi e bilanciati ogni 48 ore.
- Se lo si desidera, aliquotare i vecchi terreni di coltura a fette con una pipetta per l'uso immediato nei saggi biochimici o congelare a -80 °C per un uso futuro.
