Sviluppo di un modello di coltura a tripla cellula della barriera emato-encefalica umana

Abstract

Fonte: Fattakhov, N., et al. Un modello di coltura cellulare primaria tripla della barriera emato-encefalica umana per lo studio dell'ictus ischemico in vitro. (2022)

Questo video dimostra la co-coltura di cellule cerebrali umane di periciti, astrociti ed endoteli. Ogni strato cellulare viene formato separatamente e poi coltivato insieme, creando un sistema a tre strati che imita la disposizione cellulare della barriera emato-encefalica

Protocollo

1. Impostazione del modello BBB a tripla coltura cellulare

1. Semina dei periciti
   1. Coltivare HBVP (periciti vascolari cerebrali umani) in fiasche di coltura T75 con una superficie attivata per l'adesione cellulare all'interno di un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C fino a quando non diventa confluente. Una volta raggiunta la confluenza, aspirare il vecchio terreno pericitario e lavare le cellule con 5 mL di soluzione salina tiepida tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS). Aspirare il DPBS e staccare le cellule dal matraccio utilizzando una combinazione di 4 mL di soluzione tiepida di tripsina-EDTA e 1 mL di DPBS.
      NOTA: Evitare di utilizzare passaggi successivi a P7.
   2. Incubare il pallone per 5 minuti a 37 °C in un incubatore di CO₂. Osservare al microscopio per confermare se le cellule sono staccate dal pallone. Aggiungere 5 mL di terreno pericitario caldo (contenente il 2% di siero fetale bovino [FBS]) nel pallone e trasferire le cellule staccate in una provetta da centrifuga da 50 mL.
   3. Centrifugare la sospensione cellulare per 3 minuti a 200 × g, lasciando che le cellule formino un pellet sul fondo della provetta. Aspirare il fluido dal tubo, assicurandosi che il pellet della cella rimanga intatto.
   4. Risospendere il pellet cellulare nel terreno pericitario; calcolare la quantità di terreno in base alla confluenza delle cellule e al numero di inserti dei pozzetti necessari. Prelevare 10 μl di cellule risospese, posizionarle in un vetrino contacellule e contare il numero di cellule.
   5. Determinare la densità cellulare e seminare 300.000 cellule/inserto in 1 mL di terreno pericitario sul lato abluminale degli inserti a pozzetti (formato a 6 pozzetti).
      nota: Quando si semina l'HBVP sul lato inferiore degli inserti, è importante capovolgere le piastre di inserimento del pozzetto. Mentre la piastra è appoggiata su una superficie, rimuovere la sezione inferiore per esporre il lato abluminale degli inserti del pozzetto. Coprire gli inserti del pozzetto con la piastra capovolta dopo aver aggiunto la sospensione di cellule pericitarie sul lato abluminale per evitare l'evaporazione. Tenere tutte le piastre capovolte in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C per una notte.
2. Semina degli astrociti
   1. Coltivare HA (Astrociti umani) in fiasche T75 all'interno di un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C fino al raggiungimento della confluenza. Segui i passaggi precedenti 1.1.1-1.1.4 utilizzando il terreno degli astrociti (contenente anche il 2% di FBS) invece del terreno dei periciti.
      NOTA: Evitare di utilizzare passaggi successivi a P9.
   2. Determinare la densità cellulare e seminare 300.000 cellule/pozzetto sul fondo delle piastre a 6 pozzetti per la coltura tissutale. Coprire la piastra per evitare l'evaporazione e conservare tutte le piastre in un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C per una notte.
3. Semina di cellule endoteliali
   1. Coltivare HBMEC (cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane) in piastre di coltura tissutale all'interno di un incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C fino a quando non diventa confluente. Seguire i passaggi precedenti 1.1.1-1.1.4 utilizzando un terreno classico completo (contenente il 10% di FBS) invece di un terreno pericitario.
      nota: Evitare di utilizzare passaggi successivi a P12.
   2. Estrarre le piastre a 6 pozzetti per coltura tissutale contenenti astrociti e gli inserti a pozzetti (formato a 6 pozzetti) contenenti periciti dall'incubatore al 5% di CO₂ a 37 °C. Aspirare il terreno di coltura degli astrociti dalle piastre a 6 pozzetti per coltura tissutale. Aggiungere 1 mL di terreno pericitario e 1 mL di terreno astrocitario a ciascun pozzetto.
   3. Aspirare il terreno pericitario dagli inserti dei pozzetti e posizionarlo nelle piastre a 6 pozzetti per la coltura tissutale contenenti gli astrociti seminati. Seminare HBMEC a una densità di 300.000 cellule/pozzetto in 2 mL del terreno classico completo sul lato apicale degli stessi inserti del pozzetto.
      nota: Le cellule endoteliali devono essere seminate sul lato apicale degli inserti del pozzetto il giorno successivo dopo aver seminato i periciti sul lato abluminale degli inserti del pozzetto e gli astrociti su piastre a 6 pozzetti per colture tissutali. Le cellule devono essere mantenute in tripla coltura per sei giorni per indurre proprietà simili alla BBB. Il terreno di coltura cellulare deve essere sostituito in entrambi i compartimenti con inserto a pozzetto 24 ore prima degli esperimenti.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Transwell da 24 mm con inserto a membrana in poliestere con pori da 0,4 μm	Corning	3450
Piatti con fondo in vetro da 35 mm	MatTek Scienze della Vita (FISHERSCI)	P35GC-1.5-14-C
Astrocita Medium	Scienza Cell	Anno 1801
Fattore di attacco	Sistemi cellulari (Fisher Scientific)	4Z0-201
Completo di terreno classico con siero e CultureBoost	4Z0-500	Sistemi cellulari
Provette da centrifuga Corning 50 mL in PP (fondo conico con tappo CentriStar	VWR	430829
Corning 75cm² Collo inclinato a forma di U non trattato pallone per colture cellulari	Corning	Codice 431464U
Corning CellBIND 96-well fondo piatto in polistirene nero Micropiastre	Corning	Telefono 3340
Conta i vetrini della camera di conteggio delle cellule	Thermo Fisher Scientifico	Codice: C10228
Contacellule automatizzato Countess II FL	Thermo Fisher Scientifico	ZGEXSCCOUNTESS2FL
DMEM Medium (Senza glucosio, Senza glutammina, Senza rosso fenolo)	ThermoFisher	Codice A14430-01	Terreno privo di glucosio
DPBS (senza calcio, senza magnesio)	ThermoFisher	14190250
Terreno basale di crescita delle cellule endoteliali EBM, senza rosso fenolo, 500 mL	Lonza	CC-3129
Incubatore a CO2
centrifuga