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1. Sintesi di gelatina metacriloil (GelMA)
- Pesare 10 g di gelatina ottenuta dalla pelle del suino e sciogliere in 100 mL di PBS lasciando agitare la soluzione su una piastra riscaldante a 240 giri/min e 50 °C fino a completa dissoluzione.
- Sotto una cappa, aggiungere 2 mL di anidride metacrilico (MA) per un basso grado di funzionalizzazione e lasciare agitare l'emulsione di gelatina a 240 giri/min e 50 °C per 2 h.
cautela: Indicazione di pericolo AIC: H302 + H332 (nocivo se ingerito o inalato), H311 (tossico a contatto con la pelle), 314 (provoca gravi ustioni cutanee e danni agli occhi), 315 (provoca irritazione cutanea), H317 (può causare una reazione allergica cutanea), H318 (provoca gravi lesioni oculari), 331 (tossico se inalato), H332 (nocivo se inalato), H335 (può causare irritazione respiratoria). Linee guida per l'uso: P261 (evitare di respirare polvere/fumi/gas/nebbia/vapori/spray), P305 + P351 + P338 + P310 (IN CASO DI CONTATTO CON GLI OCCHI: Sciacquare accuratamente con acqua per diversi minuti. Rimuovere le lenti a contatto, se presenti e facili da fare. Continuare a risciacquare. Chiamare immediatamente un CENTRO ANTIVELENI / un medico), P301 + P312 + P330 (IN CASO DI INGESTIONE: chiamare un CENTRO ANTIVELENI / un medico se non ci si sente bene. Sciacquare la bocca).
nota: Aggiungere MA molto lentamente, goccia a goccia.
- Diluire la soluzione di gelatina-MA in 100 mL di PBS preriscaldato (50 °C) per ottenere 200 mL di volume finale e lasciare agitare la soluzione a 240 giri/min e 50 °C per 10 min.
- Tagliare ~20 cm di membrana per dialisi (taglio molecolare 12-14 kDa) e immergerla in acqua deionizzata fino a quando non diventa morbida.
nota: Riempire le membrane con acqua deionizzata per assicurarsi che non vi siano buchi o difetti.
- Utilizzando un imbuto, trasferire la soluzione di gelatina-MA sulle membrane.
nota: Chiudere entrambi i lati lasciando più spazio all'interno per consentire il composto.
- Mettere le membrane contenenti la soluzione di gelatina-MA in un contenitore con 2 L di acqua distillata per dialisi e lasciarle agitare a 40 °C per 5 giorni (500 giri/min).
nota: Coprire il contenitore per evitare l'evaporazione dell'acqua.
- Cambiare l'acqua distillata due volte al giorno. Ogni volta, capovolgere le membrane per omogeneizzarle.
- Il quinto giorno, mescolare 200 ml di acqua ultrapura preriscaldata (40 °C) con la gelatina-MA dializzata e mescolare per 15 minuti a 40 °C.
- Trasferire la soluzione di gelatina-MA in provette coniche da 50 mL fino a 25 mL e lasciare che le provette rimangano a -80 °C per 2 giorni.
nota: Conservare i tubi orizzontalmente per facilitare la liofilizzazione.
- Liofilizzare le soluzioni surgelate per 3-5 giorni e conservare il GelMA liofilizzato al riparo dall'umidità.
2. Preparazione Bioink
NOTA: Per ottenere 1 mL di bioink, si consiglia di fabbricare almeno 3 mL di soluzione di biomateriale, poiché potrebbero esserci perdite durante la filtrazione.
- Preparazione della soluzione di fibrinogeno
- Preparare una soluzione salina (NaCl 0,9%) in acqua deionizzata e sciogliere 10 mg di fibrinogeno dal plasma bovino in 1 mL di soluzione salina per ottenere una concentrazione di 10 mg/mL.
nota: Poiché il fibrinogeno si adsorbe sul vetro, non utilizzare palloni di vetro per preparare la soluzione di fibrinogeno.
- Lasciare la soluzione sotto agitazione a 37 °C fino alla completa dissoluzione del fibrinogeno.
NOTA: Per la dissoluzione del fibrinogeno, utilizzare un sistema rotante posto all'interno di un forno a 37 °C. È adatta anche l'agitazione magnetica (180 giri/min) del fibrinogeno su una piastra calda a 37 °C. In questa condizione, 10 mg/mL di fibrinogeno impiegano circa 40 minuti per dissolversi.
- Preparazione della soluzione di gelatina/GelMA
- Pesare 0,12 g di gelatina e aggiungerla a 1,9 mL di PBS preriscaldato (40 °C) per ottenere una concentrazione finale del 4% (p/v) di gelatina. Vortice per facilitare la dissoluzione.
- Mantenere l'emulsione a 40 °C fino alla completa dissoluzione.
- Pesare 0,06 g di GelMA liofilizzato e trasferirlo nella soluzione di gelatina per ottenere una concentrazione finale del 2% (p/v) di GelMA. Vortice per facilitare la dissoluzione.
- Conservare la soluzione a 40 °C fino alla completa dissoluzione.
3. Preparazione di gelatina carica di astrociti/GelMA/bioink di fibrinogeno
- Pipettare 0,9 mL della soluzione di fibrinogeno da 10 mg/mL e trasferirla nella soluzione di gelatina/GelMA per ottenere una concentrazione finale di 3 mg/mL di fibrinogeno.
- Pesare 0,015 g di fotoiniziatore (PI) e trasferire nella soluzione di gelatina/GelMA/fibrinogeno per ottenere una concentrazione finale dello 0,5% (p/v) di PI. Mescolare la soluzione capovolgendo il tubo verso l'alto e verso il basso e mantenerlo a 40 °C al riparo dalla luce per evitare la degradazione PI.
nota: Conservare il bioink a 4 °C per un massimo di 24 ore.
- Sotto il flusso laminare, filtrare la soluzione utilizzando un filtro da 0,2 μm in una provetta conica sterile da 15 mL.
nota: La soluzione del biomateriale deve essere a 37-40 °C per consentire la filtrazione.
- Trasferire 980 μl della soluzione del biomateriale in una provetta conica da 15 mL.
- Diluire la laminina in soluzione salina per ottenere una soluzione madre di 100 μg/mL.
- Pipettare 20 μL di laminina e trasferirla nella provetta contenente il bioink per ottenere una concentrazione finale di 2 μg/mL di laminina.
- Mescolare delicatamente pipettando su e giù, evitando bolle. Se le bolle persistono, centrifugare la provetta conica a 200 x g per 2 minuti. Conservare il bioink a 37 °C fino a quando non si mescola con le cellule.
- Tripsinizzare gli astrociti primari con tripsina allo 0,05% per 5 min.
nota: Usa gli astrociti dai passaggi da 1 a 3.
- Neutralizzare l'attività della tripsina con FBS in un rapporto di 1:1 e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
- Contare le cellule e trasferire 1 x 106 cellule in una provetta conica diversa. Centrifugare a 200 x g per 5 min.
- Rimuovere il surnatante lasciando un piccolo volume (~200 μL) per sospendere il pellet cellulare, picchiettando delicatamente il fondo del tubo conico.
- Trasferire 1 mL di soluzione di gelatina/GelMA/fibrinogeno nella provetta contenente le cellule e pipettare delicatamente su e giù per omogeneizzare, ottenendo una concentrazione finale di 1 x 106 cellule/mL.
3. Preparazione della soluzione di reticolante
- Ricostituzione della trombina
- Preparare una soluzione madre di trombina 100 U/mL in acqua deionizzata sterile con albumina sierica bovina (BSA) allo 0,1% (p/v) in una provetta conica da 15 mL. Stock in microprovette a -20 °C.
NOTA: Poiché la trombina si adsorbe al vetro, non utilizzare palloni di vetro per preparare la soluzione madre o conservare le aliquote.
- Preparazione della soluzione di trombina-CaCl2
- Pipettare 100 μL di soluzione madre di trombina e trasferirla in una provetta conica da 50 mL contenente 8,9 mL di acqua deionizzata sterile per ottenere una concentrazione finale di 1 U/mL di trombina.
- Preparare una soluzione di CaCl2 al 10% (p/v) in acqua deionizzata e sterilizzare utilizzando un filtro da 0,2 μm.
- Trasferire 1,1 mL della soluzione di CaCl2 al 10% nella provetta conica contenente trombina per ottenere un rapporto finale di 1:9 (CaCl2 per trombina).
nota: Preparare la soluzione reticolante al volume per l'esperimento, evitando lo stoccaggio.
4. Bioprinting bioink carico di astrociti utilizzando un bioprinter basato sull'estrusione
- Progettazione del tessuto neurale
- Utilizzando il codice G: costruire una griglia di 6 x 6 mm (forma quadrata) con 1 mm di distanza tra ogni linea biostampata sugli assi X e Y e 6 strati sull'asse Z (0,2 mm tra ogni linea); impostare l'estrusione (E) su 0,01 mm, aumentando di 0,001 mm ad ogni nuovo strato dell'asse Z; e impostare la velocità di stampa (F) su 400 mm/min (Informazioni supplementari).
- Configurazione della biostampante
- Esporre la macchina alla luce UV per 15 minuti, quindi pulirla con etanolo al 70%.
- Accendere la biostampante utilizzando l'interruttore di alimentazione. Collegare la macchina al computer tramite un cavo USB. Apri il software di controllo per collegarlo alla biostampante e caricare il file di design.
- Preparazione della siringa per bioprinting
- Trasferire il bioink di gelatina/GelMA/fibrinogeno carico di astrociti in una siringa di plastica da 5 ml utilizzando una pipetta da 1.000 μl.
nota: Trasferire lentamente per evitare la formazione di bolle.
- Collegare un ago smussato sterile da 22 G alla siringa.
nota: Lasciare la siringa a 4 °C per 2 minuti.
- Collegare la siringa alla testina di stampa della bioprinter e lavare manualmente il bioink per rimuovere le bolle rimanenti.
- Bioprinting
NOTA: La biostampa è stata eseguita all'esterno della cappa laminare.
- Posizionare una piastra di coltura da 35 mm sul tavolo della biostampante e posizionare l'ago a 0,1 mm di distanza dalla superficie della piastra di coltura per consentire il movimento dell'ago.
NOTA: Utilizzare una piastra di coltura da 35 mm per ogni bioprinting.
- Premere il pulsante Stampa.
- Una volta terminato il bioprinting, assicurarsi che la siringa si allontani dal piatto. Quindi, chiudi il piatto di coltura e preparati per il processo di reticolazione.
nota: La biostampa di un costrutto richiede circa 1 minuto e 10 secondi.
- Reticolazione del costrutto biostampato e della cultura
- Posizionare la piastra di coltura sotto la luce UV a 2 mW/cm2 per 2 x 60 s (su e giù) per la reticolazione GelMA.
- Sotto il flusso laminare, trasferire il costrutto biostampato su una piastra a 24 pozzetti utilizzando una spatola sterile.
- Aggiungere 500 μL di soluzione di trombina/CaCl2 e lasciare agire per 30 minuti per consentire la reticolazione della fibrina.
- Rimuovere la soluzione reticolante e lavare il costrutto con 2 mL di PBS 1x. Quindi, sostituire il PBS con 1 mL di terreno di coltura per astrociti e incubare a 37 °C e 5% di CO2. Cambia il mezzo ogni 3 giorni.