Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Tiolazione dell'acido ialuronico
NOTA: I rapporti molari sono indicati rispetto a un numero totale di gruppi carbossilati se non diversamente specificato.
- Sciogliere 500 mg di ialuronato di sodio (HA, 500-750 kDa) a 10 mg/mL in acqua distillata deionizzata (DiH2O) in un pallone di Erlenmeyer da 250 mL sterilizzato in autoclave. Mescolare la soluzione (~200 giri/min) a temperatura ambiente per 2 ore per sciogliere completamente l'HA. Utilizzare una barra di agitazione e una piastra di agitazione magnetica per mantenere la reazione durante la procedura di tiolazione.
- Utilizzando acido cloridrico 0,1 M (HCl), regolare il pH della soluzione di HA a 5,5. Pesare 69,6 mg (rapporto molare 0,25x) di 1-etil-3-(3-dimetilamminopropil) carbodiimmide (EDC).
nota: Sebbene l'EDC non disciolto possa essere aggiunto direttamente alla soluzione di HA, in genere è più facile sciogliere l'EDC prima in 1 mL di DiH2O e poi aggiungere rapidamente la soluzione EDC alla soluzione di HA. La pre-dissoluzione in 1 mL di DiH2O può essere effettuata anche con N-idrossisuccinimide (NHS) e cistamina diidrocoloride prima di aggiungerla alla reazione nelle fasi 1.3 e 1.4.
- Aggiungere 17,9 mg (rapporto molare 0,125x) di NHS alla reazione. Regolare il pH della soluzione di reazione a 5,5 utilizzando 0,1 M di HCl e incubare la reazione a temperatura ambiente per 45 minuti.
- Aggiungere 70,0 mg (rapporto molare 0,25x) di cistamina dicloridrato nella soluzione di reazione. Utilizzare idrossido di sodio (NaOH) 0,1 M per regolare il pH a 6,25. Incubare la reazione a temperatura ambiente per una notte mescolando.
- Il giorno successivo, utilizzare 1 M di NaOH per regolare il pH della soluzione di reazione a circa 8. Aggiungere 192 mg (rapporto molare 4x) di ditiotreitolo (DTT) alla reazione. Regolare il pH a 8 dopo l'aggiunta di DTT e lasciare mescolare per 1-2 ore a temperatura ambiente.
- Utilizzare 1 M di HCl per regolare il pH a 4. Trasferire l'intera miscela di reazione in una membrana di dialisi pre-imbevuta (cut-off del peso molecolare di circa 13 kDa) e dializzare contro DiH2O pre-regolato a pH 4,
nota: Il volume di DiH2O per la dialisi deve essere almeno 40 volte il volume della soluzione di HA reagita (ad esempio, 50 mL di campione in 2 L di DiH2O, pH 4).
- Sostituire la soluzione di dialisi (DiH2O, pH 4) due volte al giorno per 3 giorni a temperatura ambiente.
- Filtrare la soluzione dialitizzata attraverso una membrana da 0,22 μm, filtro a vuoto. Soluzione di congelamento rapido di HA tiolato in azoto liquido. Utilizzare un liofilizzatore per liofilizzare i campioni secchi per 2 giorni. L'HA tiolato in forma secca può essere conservato in un essiccatore sottovuoto a -20 °C per almeno 6 mesi.
- Per determinare il grado di tiolazione, utilizzare il test di Ellman e/o la spettroscopia NMR protonica.
2. Preparazione dei materiali per la reticolazione
- Sciogliere l'HA tiolato alla concentrazione desiderata (in questo esempio, 13,3 mg/mL) in soluzione salina tamponata HEPES (20 mM di HEPES nel tampone salino bilanciato di Hank (HBSS), regolato per rientrare in un pH di 8-9) in una fiala ambrata per ridurre al minimo l'esposizione alla luce ambientale. Mantenere la soluzione in costante agitazione.
nota: La formazione di legami disolfuro tra i tioli coniugati all'HA può verificarsi se il pH è superiore a 8, se la concentrazione della soluzione è troppo alta o se la soluzione viene lasciata agitare troppo a lungo prima della gelificazione. Per evitare questo problema, utilizzare meno di 15 mg/mL di HA tiolato e sciogliere l'HA tiolato entro 2 ore dalla formazione di idrogel.
- Sciogliere 4 bracci-PEG-maleimmide (PEG-Mal, 20 kDa) e 4-br-PEG-tiolo (PEG-tiolo, 20 kDa) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4, per preparare 50 mg/mL di PEG-Mal e PEG-tiolo.
nota: Ci vuole almeno 1 ora per sciogliere completamente i reagenti PEG.
- Se si aggiungono peptidi derivati dalla ECM, sciogliere i peptidi contenenti cisteina in PBS per preparare una soluzione madre.
nota: Utilizzare una concentrazione di stock di 2-4 mM.
- Immergere gli stampi in gomma siliconica in etanolo per almeno 20 minuti per pulirli e poi sterilizzarli in autoclave.
3. Reticolazione dell'idrogel e incapsulamento cellulare
NOTA: A titolo di esempio, viene descritto l'incapsulamento di quattro singoli idrogel da 80 μL con HA allo 0,5% (p/v) e modulo di compressione di 1 kPa3. Si prega di consultare la Tabella 1, ad esempio, ricette che producono idrogel con proprietà variabili: due idrogel che incorporano il peptide legante l'integrina RGD e due idrogel che incorporano tappi di cisteina come controllo negativo per l'attività del peptide. La concentrazione di semina delle cellule GBM derivate dal paziente è di 500.000 cellule/mL.
- Diluire la soluzione madre di PEG-Mal (50 mg/mL, dal passaggio 2.2) a 12,5 mg/mL aggiungendo 40 μL della soluzione madre a 120 μL di PBS. Dividere la soluzione diluita in due provette per microcentrifuga da 1,5 mL, ciascuna da 80 μl.
- Aggiungere 16 μL di soluzione madre di RGD (2,8 mM, dal passaggio 2.3) a una provetta e 16 μL di soluzione madre di cisteina (2,8 mM, dal passaggio 2.3) alla seconda provetta. Vortice per mescolare. Posizionare le soluzioni PEG-Mal-RGD o PEG-Mal-CYS sul ghiaccio fino all'uso al punto 3.9.
nota: La procedura qui descritta produce idrogel con ~140 μM di peptide. Ciò equivale a circa 1 su 8 bracci PEG disponibili occupati da un peptide. Questo può essere variato alterando il rapporto molare dei peptidi terminati con cisteina rispetto ai gruppi maleimmidici disponibili. In generale, è possibile raggiungere una concentrazione massima di 280 μM di peptide lasciando comunque un numero sufficiente di gruppi maleimmidici disponibili per la reticolazione dell'idrogel.
- Diluire la soluzione madre di PEG-tiolo (50 mg/mL, dal passaggio 2.2) a 5 mg/mL mescolando 4 μL di soluzione madre da 50 mg/mL con 36 μL di PBS. Aggiungere alla miscela 120 μl di acido ialuronico tiolato disciolto dal passaggio 2.1.
nota: Le soluzioni di HMW HA sono molto viscose. Pertanto, si consiglia di utilizzare una punta per micropipetta a orifizio largo per trasferire le soluzioni. Pipettare lentamente per evitare che la soluzione si attacchi alle pareti del puntale della micropipetta e per migliorare l'accuratezza della misurazione.
- Posizionare gli stampi puliti e asciutti (preparati al punto 2.4) in ciascun pozzetto di una piastra a 12 pozzetti non trattata con coltura tissutale. Utilizzando l'estremità pulita e smussata di un puntale per pipetta, premere lo stampo in gel e ricontrollare la tenuta tra gli stampi e il fondo della piastra a pozzetti.
nota: Controllare nuovamente la guarnizione subito prima dell'incapsulamento per evitare perdite.
- Le cellule GBM coltivate in passaggio si dissociano in singole cellule e determinano la concentrazione cellulare come descritto in precedenza3.
nota: Alcune linee GBM non possono essere dissociate in singole cellule. In questo caso, intere gliomasfere possono essere incapsulate. Tuttavia, preparare singole cellule dissociate dopo un conteggio preciso delle cellule per migliorare la riproducibilità. Il protocollo per il passaggio della gliomasfera varia tra i diversi laboratori e molti di questi sono probabilmente compatibili con l'incapsulamento in idrogel.
- (Consigliato) Centrifugare le gliomasfere a 500 x g per 5 minuti. Rimuovere il surnatante e aggiungere 1 mL di enzima di dissociazione cellulare al pellet cellulare. Quindi, incubare per 5 minuti, picchiettando delicatamente la provetta per agitare.
- Aggiungere 4 mL di terreno di coltura completo (50 ng/mL EGF, 20 ng/mL FGF-2, 25 μg/mL di eparina, integratore G21 e 1% di penicillina/streptomicina in DMEM/F12) alle cellule.
- Centrifugare nuovamente a 500 x g per 5 minuti e rimuovere il surnatante. Infine, risospendere il pellet cellulare in 1 mL del terreno completo e far passare le cellule sospese attraverso un filtro cellulare da 70 μm. (Consigliato) lavare il colino con altri 4 ml del terreno completo per massimizzare il numero di cellule recuperate.
- Stimare la concentrazione di cellule nella sospensione utilizzando un emocitometro. Dividi la sospensione cellulare in 2 provette da centrifuga, dove ogni provetta contiene ~80.000 cellule. Centrifugare a 500 x g per 5 min; in genere, 80.000 cellule costituiscono 2 idrogel da 80 μL.
- Rimuovere il surnatante e risospendere un pellet in 80 μl di soluzione di PEG-MAL-RGD e un secondo pellet in 80 μl di soluzione di PEG-MAL-CYS (preparato al punto 3.1).
- Utilizzando un puntale per micropipetta a orifizio largo da 200 μl, erogare 40 μl di soluzione di HA (dal passaggio 3.3 precedente) in ciascuno stampo in silicone di gomma (come preparato al punto 3.4).
- Utilizzando un puntale per micropipetta a orifizio largo da 200 μl, miscelare i 40 μl di soluzione cellulare PEG-MAL-CYS o PEG-MAL-RGD con la soluzione di HA nello stampo. Pipettare rapidamente su e giù non più di 10 volte. Ripetere per ogni coltura di gel in preparazione.
nota: Questo passaggio richiede pratica, poiché la gelificazione iniziale avviene rapidamente (entro 30 s). Pipettare su e giù spostando il puntale in posizioni diverse negli stampi per garantire una miscelazione uniforme. Tenere sempre la punta al di sotto del livello del liquido per evitare la formazione di bolle d'aria. Non mescolare la soluzione troppe volte poiché il gel potrebbe formarsi all'interno del puntale della micropipetta. PEG-MAL-CYS e PEG-MAL-RGD possono essere combinati a rapporti variabili per ottenere la concentrazione di peptide RGD desiderata.
- Posizionare la piastra a pozzetti contenente cellule incapsulate in gel in un incubatore per colture cellulari a 37 °C per 5-10 minuti per garantire il completamento della reazione.
- Aggiungere 2-2,5 ml di terreno di coltura a ciascun pozzetto con i gel formati. Utilizzare un puntale per pipetta sterile da 2 μl o una microspatola per separare delicatamente lo stampo e il gel. Utilizzare una pinza pre-sterilizzata per rimuovere lo stampo dalla piastra a pozzetti. Riposizionare la piastra a pozzetti nell'incubatore cellulare (37 °C e 5% di CO2) per la coltura e gli esperimenti futuri.
nota: Tirare lo stampo verticalmente verso l'alto per evitare di danneggiare le colture di gel. In generale, il terreno nelle colture in gel deve essere sostituito ogni 3-4 giorni. Fare attenzione a non aspirare gli idrogel quando si rimuove il terreno. In caso di problemi, si consiglia di utilizzare una pipetta di trasferimento in plastica. Se è previsto l'imaging a bioluminescenza per tracciare il numero di cellule, le cellule GBM devono essere trasdotte con lentivirus che codifica costitutivamente l'espressione della luciferasi prima dell'incapsulamento, come descritto in precedenza3. Per l'imaging a bioluminescenza, aggiungere 1 mM di D-luciferina al terreno di coltura 1 ora prima dell'imaging a luminescenza.
