1. Preparazione prima delle colture organotipiche di fette cerebellari
- In una cappa per colture cellulari spruzzata con etanolo al 70%, preparare 200 mL di terreno di coltura in un filtro sottovuoto da 250 mL collegato a un contenitore per flaconi sterile. Aggiungere 100 ml di Aquila media basale (BME), 50 ml di soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS), 50 ml di siero di cavallo inattivato termicamente, 1 ml di 200 mM di L-glutammina (concentrazione finale 1 mM) e 5 ml di 200 g/L di glucosio (concentrazione finale 5 mg/mL). Filtrare sottovuoto il terreno di coltura e mantenerlo a +4 °C per un massimo di un mese.
- Nella cappa di biosicurezza sterilizzata, estrarre dalla confezione una piastra di coltura a 6 pozzetti. Riempire ogni pozzetto con 1 mL di terreno di coltura. Se viene testato un trattamento, aggiungere l'agente farmacologico al pozzetto trattato e lo stesso volume di soluzione del veicolo per il pozzetto di controllo. Nel presente studio, abbiamo aggiunto 1 μL di soluzione sterile 3 M KCl al pozzetto trattato (30 mM finale) e 1 μL di acqua sterile ai pozzetti di controllo.
- Portare all'interno della cappa di coltura cellulare il numero necessario di inserti per colture cellulari confezionati singolarmente con membrana idrofila in politetrafluoroetilene (PTFE) (dimensione dei pori = 0,4 μm). Scartarli con cura ed estrarre gli inserti di coltura cellulare con una pinza sterile. Lasciarli cadere uno per uno in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, evitando bolle all'interfaccia tra la membrana dell'inserto e il terreno di coltura cellulare. Lasciare equilibrare gli inserti nel terreno in un incubatore a 37 °C, CO2 al 5% per almeno 2 ore prima della coltura.
nota: Il trinciatessuti risiede permanentemente nella cappa di coltura cellulare.
- Preparare due becher da 200 mL, uno riempito con 150 mL di acqua sterile e l'altro riempito con 150 mL di etanolo al 70%. Immergere gli strumenti chirurgici nel bagno di etanolo al 70% e poi in acqua prima di utilizzarli.
nota: Non utilizzare strumenti chirurgici subito dopo il contatto con l'etanolo.
- Disinfettare la lama a doppio taglio nel becher di etanolo al 70%. Posizionarlo sul portalama utilizzando una pinza sterile e tenerlo in posizione utilizzando la chiave di bloccaggio della lama. Lascialo asciugare fino al momento dell'uso.
- Disinfettare il disco di plastica fornito con il tritatutto nel becher di etanolo al 70%. Spruzzare il tavolo da taglio con etanolo al 70% prima di posizionare il disco su di esso. Lasciare asciugare fino al momento dell'uso.
2. Dissezione e colture di fette organotipiche cerebellari
- Portare il cucciolo di topo all'interno della cappa di coltura cellulare per eseguire la dissezione.
- Decapitare rapidamente il cucciolo usando le forbici dritte (Figura 1A).
- Tenendo la testa del cucciolo per il naso con una pinza da medicazione dritta, taglia il cuoio capelluto usando le forbici per gli occhi dritti, partendo dall'estremità posteriore e andando lateralmente alla linea mediana.
- Procedi in modo identico per il cranio.
nota: Assicurati di puntare le punte delle forbici verso l'esterno per evitare di danneggiare il cervelletto durante la dissezione.
- Estrarre il cervello e trasferirlo in una capsula da 60 mm riempita con HBSS freddo + 5 mg/mL di glucosio.
- Sezionare con cura il cervelletto utilizzando una pinza fine dritta sterile (Figura 1B). Trasferirlo sul disco di plastica posto sul tavolo da taglio del tritatessuti utilizzando una pinza fine curva sterile.
- Orientare il tessuto ruotando il tavolo da taglio per eseguire sezioni parasagittali.
- Spostare il tavolo da taglio tirando la manopola di rilascio del tavolo verso destra, in modo che la lama sia posizionata sul bordo del tessuto.
- Regolare lo spessore della fetta a 350 μm e la velocità della lama a media.
- Avvia l'elicottero. Una volta che l'intero cervelletto è stato affettato (Figura 1C), spegnere il tritatutto.
- Rimuovere il disco di plastica con una pinza sterile.
- Avvicinare con cautela il disco di plastica a una piastra da 60 mm contenente HBSS + 5 mg/mL di glucosio. Pipettare l'HBSS freddo + 5 mg/mL di glucosio sul tessuto utilizzando una pipetta di trasferimento sterile per consentire il prelievo di fette cerebellari nel piatto riempito di tampone.
- Separare le fette cerebellari l'una dall'altra utilizzando una microsonda. Prelevare le sezioni di buona qualità con la pipetta di trasferimento (si consiglia di utilizzare sezioni di tessuto vicine al verme) e inserirle in un inserto per colture cellulari pre-bilanciato (Figura 1D).
- Posizionare le fette cerebellari sull'inserto di coltura cellulare utilizzando la microsonda, quindi rimuovere con cautela l'eccesso di HBSS + 5 mg/mL di soluzione di glucosio con la pipetta di trasferimento.
nota: In questa fase il tessuto è estremamente dolente e soggetto a danni fisici. Il numero massimo di fette cerebellari per inserto di coltura cellulare dipende dall'età dell'animale donatore. 6-8 fette possono essere coltivate per un animale di età P0-P4 e 4-6 fette per animali di età superiore a P5.
- Metti il piatto di coltura nell'incubatrice, cambiando completamente il terreno ogni 2-3 giorni.
- Per valutare la sopravvivenza delle cellule di Purkinje, le fette possono essere raccolte già dopo 5 giorni in vitro. Per altri scopi, possono essere mantenuti in coltura per diverse settimane (Figura 1F).
nota: Nel caso degli esperimenti di sopravvivenza cellulare di Purkinje, non è necessario rinnovare il trattamento farmacologico quando si cambia il terreno di coltura cellulare (Figura 1F).
3. Immunofluorescenza
- Estrarre la piastra a 6 pozzetti dall'incubatore. Rimuovere il terreno di coltura cellulare, lavare l'inserto per coltura cellulare con 1x PBS e fissare le fette con una soluzione fredda di paraformaldeide al 4% per 1 ora, con 1 mL sotto l'inserto per colture cellulari e 500 μL sopra l'inserto per colture cellulari.
- Lavare gli inserti 4 volte per 10 minuti con 1 PBS, con 1 mL sotto e 500 μL sopra l'inserto, su un agitatore orbitale.
- Con un pennello, trasferire le fette cerebellari da 1 inserto di coltura cellulare a 1 pozzetto di 24 pozzetti pre-riempito con 1x PBS, 0,25% Triton X-100 e 3% BSA (PBS-TB), 500 μL/pozzetto.
- Permeabilizzare e bloccare le fette mediante incubazione in PBS-TB per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare con anticorpi primari diluiti nella soluzione di PBS-TB, per una notte a + 4 °C, su un agitatore orbitale, 200 μL/pozzetto.
- Il giorno successivo, eseguire quattro lavaggi di 10 minuti con 1x PBS, su un agitatore orbitale, 500 μL/pozzetto.
- Incubare con anticorpi secondari diluiti nella soluzione di PBS-TB, due ore a temperatura ambiente, su un agitatore orbitale e al riparo dalla luce, 200 μL/pozzetto.
- Eseguire quattro lavaggi di 10 minuti con 1x PBS, su un agitatore orbitale, 500 μL/pozzetto.
- Controcolorare le fette con Hoechst 33342, diluito in 1x PBS (2 μg/mL), per 10 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce, 500 μL/pozzetto.
- Montare le fette cerebellari su un vetrino per microscopia con una pipetta di trasferimento. Lasciarli asciugare completamente all'aria, al riparo dalla luce. Riumidificarli con 1x PBS e applicare un vetrino coprioggetti coperto con poche gocce di terreno di montaggio (~80 μL). Evita di fare bolle.
- Una volta che il mezzo di montaggio si è indurito, le sezioni cerebellari sono pronte per essere visualizzate.
4. Imaging e quantificazione della sopravvivenza cellulare
- Accendere il microscopio e i laser secondo il produttore.
- Avviare il software di acquisizione.
- Utilizzando un obiettivo 10X, individuare le fette cerebellari non alterate che presentano 9-10 lobuli (di solito sezioni cerebellari vicino al verme).
- Attiva l'acquisizione z-stack. Definisci l'intervallo dello z-stack per includere tutte le cellule di Purkinje presenti nella fetta cerebellare. Impostare una dimensione del passo di 2 μm e avviare l'acquisizione. Salvare l'immagine acquisita nel formato del produttore del software di acquisizione per conservare i metadati associati.
- Aprire il file acquisito in ImageJ utilizzando il plug-in Bio-formats.
- Vai a Image > Stacks > Z-project... (Figura 2A).
- Scegliere Intensità massima nel menu a discesa Tipo di proiezione e fare clic su OK (Figura 2B).
- Verrà generata un'immagine 2D appiattita. Fare doppio clic sullo strumento Multipunto per visualizzare la finestra dello strumento Punto. Deseleziona l'opzione Etichetta punti per facilitare la visualizzazione delle celle contate. Quindi, fare clic direttamente su un soma di una cellula di Purkinje per iniziare a contare (Figura 1E). Il numero totale di celle contate sarà indicato nella parte inferiore della finestra degli strumenti Punto (Figura 3).
nota: Di solito, è possibile quantificare almeno 3 sezioni non danneggiate contenenti 9-10 lobuli per inserto di coltura cellulare. Per valutare l'effetto neuroprotettivo di un agente farmacologico, devono essere eseguiti almeno 3 esperimenti indipendenti.
