Dissociazione e coltura di neuroni da campioni di tessuto ippocampale

Abstract

Fonte: Servello, D. et al., Un sistema microbiomeccanico per lo studio della formazione e del recupero delle varici negli assoni dei neuroni centrali. J. Vis. (2018).

Questo video dimostra la dissociazione e la coltura dei neuroni dell'ippocampo da campioni di tessuto dell'ippocampo utilizzando dissociazioni enzimatiche e meccaniche. Il trattamento con Ara-C inibisce la crescita delle cellule non neuronali, facilitando la crescita selettiva dei neuroni dell'ippocampo.

Protocollo

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Dissezione, dissociazione e coltura dei neuroni dell'ippocampo da un topo/ratto gravido

1. Dissezione e dissociazione dei neuroni ippocampali per la coltura
   1. Scongelare la soluzione enzimatica di proteasi (3 mg/mL di proteasi 23 in soluzione di dissezione Slice, SLDS, Tabella 1) e il terreno di placcatura pre-riscaldato (Tabella 2) a 37 °C.
   2. Sezionare l'ippocampo e risciacquare con SLDS.
      nota: Quattro ippocampi forniscono celle sufficienti per una piastra a 24 pozzetti o una a 6 pozzetti.
   3. Rimuovere le SLDS, aggiungere 2 mL di soluzione enzimatica proteasi e incubare il campione a 37 °C, 5% CO₂, per 15 minuti.
   4. Lavare due volte gli espianti di ippocampo con 5-10 ml di terreno di placcatura. Aggiungere 5 ml di terreno di placcatura. Dissociare gli espianti ippocampali in singole cellule generando un piccolo vortice utilizzando una pipetta con un puntale di plastica da 1 mL. Pipettare su e giù circa 40 volte, evitando la formazione di bolle di ossigeno, fino a quando la soluzione diventa torbida e non rimangono grossi pezzi di espianto.
      nota: Ricordati di lasciare un po' di terreno durante i lavaggi, gli espianti di ippocampo dovrebbero rimanere immersi nel terreno durante l'intero processo.
   5. Centrifugare le cellule a 1,125 x g per 3 minuti. Rimuovere il surnatante con le cellule immerse nel terreno. Risospendere le cellule in 145 mL di terreno di placcatura. Aggiungere 1 mL/pozzetto della sospensione cellulare a una piastra a 24 pozzetti (3 mL/pozzetto a una piastra a 6 pozzetti).
      NOTA: 145 mL di terreno di placcatura vengono utilizzati per produrre una sospensione cellulare con una bassa densità cellulare. Questo volume consentirà la placcatura delle celle in sei piastre da 24 pozzetti, otto piastre da 6 pozzetti o varie combinazioni di piastre da 24 o 6 pozzetti, a seconda degli esperimenti da condurre. Ogni pozzetto della piastra a 24 pozzetti avrà circa 3 x 10⁴ celle.
   6. Incubare le cellule nel mezzo di placcatura a 37 °C, 5% di CO₂ per 2-4 ore, quindi rimuovere tutto il mezzo di placcatura e sostituirlo con un nuovo terreno di manutenzione.
   7. Dopo 2 giorni (2 giorni in vitro, 2DIV), sostituire metà del terreno con 2 μM di Ara-C (arabinosilcitosina) disciolto nel terreno di mantenimento, che inibisce la crescita dei fibroblasti, delle cellule endoteliali e gliali. Dopo aver esposto le cellule ad Ara-C per due giorni, sostituire il terreno con un nuovo terreno di manutenzione.

Tabella 1: Soluzione di rivestimento per vetrini. Fornisce la ricetta per preparare la soluzione di rivestimento per vetrini coprioggetti utilizzata per far aderire le cellule coltivate ai vetrini.

Soluzione di rivestimento per vetrino coprioggetti
780 μl	Acido acetico17 mM stock: 50 μL di acido acetico in 50 mL di H2O
200 μl	Poli-D-lisina (0,5 mg/mL stock)
20 μl	Collagene di coda di ratto (3 mg/mL stock)
Il volume totale è determinato in base al numero di vetrini da rivestire.

Tabella 2: Ricette di terreni di coltura cellulare. Fornisce le ricette per la preparazione di terreni utilizzati nella coltura di cellule neuronali primarie dell'ippocampo.

1x Soluzione di dissezione a fette (SLDS), filtrata, pH= 7.4, conservare a 4 °C
1 litro	ddH2O
82 mM	Na2SO4
30 mM	K2SO4
10 mM	HEPES (acido libero)
10 mM	D-glucosio
5 mM	MgCl2
0,00%	Rosso fenolo (facoltativo)
Mezzi galvanici (PM, filtro, conservare a 4 °C)
439 ml	MEM Sali di Earle
50 ml	FBS
11,25 ml	20% di D-glucosio
5 ml	Piruvato di sodio (100 mM,)
62,5 μl	L-glutammina (200 mM)
5 ml	Penicillina/Streptomicina (P/S, 100x)
Mezzi di manutenzione (MM, filtro, conservare a 4 °C)
484 ml	Neurobasale
10 ml	Supplemento B27 50x
1,25 ml	L-glutammina (200 mM)
5 ml	100x P/S
Tutte le soluzioni vengono sterilizzate utilizzando un filtro con pori di 0,2 mm.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Vetrini coprioggetti da 12 mm	Strumenti Warner	64-0702	Per piastra a 24 pozzetti
Vetrini coprioggetti da 25 mm	Fisher Scientifico	12-545-102	Per piastra a 6 pozzetti
acido acetico	Fisher Scientifico	A38-212
Poli-D-lisina	sigma	P6407
Collagene di coda di ratto	Roche	11 179 179 001
10X PBS	Diagnostica Nazionale	CL-253
Na2SO4	Fisher Scientifico	S373-500
K2SO4	Fisher Scientifico	P304-500
HEPES	Fisher Scientifico	BP410-500
D-glucosio	Fisher Scientifico	D16-500
MgCl2	Fisher Scientifico	BP214-500
NaOH	Fisher Scientifico	SS255-1
Enzima proteasi	sigma	P4032
FBS	Gibco	Codice 26140
Piruvato di sodio	Gibco	Codice 11360-070
L-glutammina	Gibco	25030081
Penicillina/Streptomicina 100x (P/S)	Gibco	15140122
MEM Sali di Earle	Gibco	Codice 11090
Supplemento B27	Gibco	Codice 17504-044
Neurobasale	Gibco	Codice 21103-049
Arabinosilcitosina (Ara-C)	sigma	Codice 147-94-4
Supporti Opti-MEM	Gibco	Codice 31985-070