Generazione di una coltura di organoidi da una sospensione di cellule tumorali cerebrali

In questo articolo

Abstract

Fonte: Sundar, S. J. et al.Mantenimento della diversità cellulare del glioblastoma umano ex vivo utilizzando la coltura di organoidi tridimensionali. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video descrive la preparazione e la coltivazione di organoidi tumorali cerebrali da sospensioni unicellulari. Utilizzando una matrice extracellulare ricca di laminina come impalcatura e terreno di coltura per i nutrienti, le cellule sono facilitate a moltiplicarsi e auto-organizzarsi all'interno dell'organoide. Di conseguenza, vengono generati organoidi ex vivo, che imitano la diversità cellulare e il microambiente dei tumori cerebrali.

Protocollo

1. Produzione di organoidi da una sospensione a singola cellula

In un secchiello del ghiaccio o in un blocco freddo, posizionare la matrice extracellulare ricca di laminina (lrECM) e una piccola provetta da centrifuga. Inserire la quantità appropriata di lrECM (16 μL x X numero di organoidi previsti) nella piccola provetta da centrifuga.
Creare una miscela di cellule in un volume totale (4 μL x X numero di organoidi previsti) contenente 20.000 cellule/organoide e aggiungerla alla piccola provetta da centrifuga con lrECM su ghiaccio.
Pipettare con cautela 20 μl della miscela di sospensione lrECM/cellulare su stampi in parafilm, formando una gocciolina simile a una perla.
1. Assicurarsi di mescolare accuratamente la miscela lrECM/sospensione cellulare, poiché le cellule tendono a depositarsi facilmente all'interno della lrECM, dando luogo a organoidi eterogenei.
2. Mantenere la miscela di sospensione lrECM/cellulare sul ghiaccio. Se lrECM si riscalda, può polimerizzare e compromettere la formazione di organoidi.
3. Assicurarsi di raffreddare il puntale della pipetta ogni due o tre organoidi per prevenire la polimerizzazione della lrECM. Non introdurre bolle d'aria negli organoidi (evitare di "spingere due volte" il puntale della pipetta).
Una volta che il numero desiderato di organoidi è stato pipettato su uno stampo in parafilm in una piastra di coltura di 10 cm, incubare a 37 °C per 1-2 ore in un incubatore per colture cellulari.
Dopo che gli organoidi si sono solidificati, si utilizza il terreno Neurobasal Media Complete (NBMc) (Tabella 1) per lavarli delicatamente dallo stampo del parafilm e inserirli in una nuova piastra di coltura sterile da 10 cm con 20 mL di NBMc totale. L'uso di un puntale Pipette-1000 (p1000) funziona meglio per eliminare gli organoidi dallo stampo; scivoleranno via dolcemente.
nota: Si consigliano circa 15-20 organoidi per piatto di coltura di 10 cm.
Mettere il piatto di coltura da 10 cm in un'incubatrice (senza agitare) per 4 giorni.
Dopo 4 giorni (Figura 1), sostituire il terreno e posizionarlo su un agitatore orbitale a 80 giri/min nell'incubatore per colture cellulari. Successivamente sostituire i file multimediali ogni 2-3 giorni.
1. Lo scambio di terreni con organoidi immaturi è impegnativo perché sono difficili da visualizzare. Inclinare la capsula di coltura cellulare e attendere almeno 20 secondi; Gli organoidi si depositeranno sul fondo e consentiranno di rimuovere lentamente il terreno dall'alto con una pipetta di vetro a grande apertura.
2. Presta molta attenzione alla raccolta degli organoidi sul fondo; se appaiono agitati dalla forza della rimozione del terreno, fai una pausa e lasciali riassestare. Man mano che gli organoidi maturano e sono più facili da visualizzare, questo processo diventa meno sfumato.
  nota: A volte, posizionare un pezzo di carta scura sotto la piastra di coltura cellulare può aiutare a visualizzare gli organoidi immaturi. Non utilizzare una pipetta Pasteur con aspirazione a vuoto per rimuovere i terreni, poiché è molto facile che gli organoidi vengano aspirati e persi in questo modo.
3. Quando gli organoidi si stabiliscono per la prima volta, non consumano terreni così rapidamente come gli organoidi maturi. Iniziare con scambi di terreni del 50% per ridurre l'uso non necessario di terreni e ridurre la possibilità di danneggiare o aspirare accidentalmente nuovi organoidi durante il processo di scambio dei terreni.

Tabella 1: Formulazione completa del mezzo neurobasale (NBMc)

componente	quantità
Mezzo neurobasale meno rosso fenolo	500 ml
Integratore di B-27 meno vitamina A (50x)	10 ml
Antibiotico-antimicotico (100x)	5 ml
Piruvato di sodio (100 mM)	5 ml
Glutammina in 0,85% NaCl (200 mM)	5 ml
FGF basico umano ricombinante (250 μg/mL)	20 μl
Proteina EFG umana ricombinante (250 μg/mL)	20 μl
Rosso fenolo	500 μl

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Risultati

figure-results-1
La Figura 1 mostra la crescita precoce degli organoidi osservata tramite microscopia ottica con ingrandimento 10x. La Figura 1A mostra la migrazione e l'invasione di singole cellule attraverso lrECM nella vista centrale. Le cellule continueranno ad espandersi e a "colonizzare" la lrECM, e appariranno più dense e infine opache all'ispezione visiva. La Figura 1B mostra diversi organoidi maturi...