Differenziazione delle cellule staminali embrionali umane in oligodendrociti

Abstract

Fonte: Assetta, B., et al. Generazione di neuroni umani e oligodendrociti da cellule staminali pluripotenti per la modellazione delle interazioni neurone-oligodendrociti. J. Vis. Exp (2020).

Questo video dimostra il processo di generazione di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) da cellule staminali embrionali umane, seguito dalla maturazione delle OPC in oligodendrociti. Questo processo di generazione di oligodendrociti apre numerose strade per migliorare la ricerca e il trattamento delle malattie neurodegenerative, tra cui l'Alzheimer.

Protocollo

1. Induzione di cellule precursori di oligodendrociti umani (OPC) da cellule staminali pluripotenti e maturazione di oligodendrociti

1. Generazione di cellule progenitrici neurali (NPC): protocollo monostrato (~7 giorni). Vedere la Figura 1A per il diagramma di flusso.
   1. Utilizzare cellule ES umane H1 disponibili in commercio al passaggio di 52 (vedi Tabella dei materiali). Coltura delle cellule su piastre a 6 pozzetti rivestite con soluzione di matrice extracellulare (~0,5 mg di soluzione di matrice per piastra a 6 pozzetti; vedere Tabella dei materiali) utilizzando un terreno di mantenimento delle cellule ES (vedere Tabella dei materiali) e incubare le piastre a 37 °C con CO₂ al 5%.
   2. Trans-differenziare le cellule in cellule progenitrici neurali (NPC) con un approccio consolidato chiamato dual SMADi, con inibitori di piccole molecole per più vie di segnalazione. Qui utilizziamo un kit commerciale ampiamente accettato e seguiamo il protocollo monostrato fornito dal produttore (vedi Tabella dei materiali).
   3. Il giorno -1, piastra 0,5-1 x 10⁶ cellule per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti rivestita da una soluzione di matrice ridotta con fattore di crescita (vedi Tabella dei materiali; ~0,5 mg di soluzione di matrice per piastra a 6 pozzetti) con terreno di mantenimento delle cellule staminali embrionali (ES) (vedi Tabella dei materiali). Questa soluzione di matrice a ridotto fattore di crescita viene utilizzata per rivestire tutte le piastre che verranno utilizzate nelle fasi successive.
   4. Il giorno 0, trattare le cellule per 24 ore con un terreno di mantenimento delle cellule ES (vedere la Tabella dei materiali) integrato con dimetilsolfossido (DMSO) al 2%.
   5. Dal giorno 1 al 6, sostituire l'intero terreno con un mezzo di induzione neurale caldo (37 °C) contenente gli inibitori SMAD del kit commerciale (vedere la Tabella dei materiali). Se le cellule si dividono e raggiungono la confluenza prima del giorno 7, passatele alla densità di semina di 0,5-1 x 10⁶, come descritto in precedenza nel passaggio 1.1.3.
   6. Il giorno 7, far passare le NPC utilizzando la soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) e la piastra a una densità di semina di 1-2 x 10⁵ cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
   7. Valutare l'efficienza della differenziazione mediante colorazione immunoistochimica (IHC) per l'assenza di marcatori di pluripotenza, come OCT4, e la presenza di marcatori NPC, come PAX6, Nestina e Sox1.
   8. In questa fase, gli NPC staccati possono essere congelati nei mezzi di congelamento NPC commerciali specializzati (vedi Tabella dei materiali) e conservati in azoto liquido per un massimo di 3 mesi. Dopo il congelamento e lo scongelamento per una volta, gli NPC conservano ancora la multipotenza per dare origine a neuroni, astrociti e OPC con protocolli affidabili.
2. Generazione di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) (~7 giorni). Si prega di consultare la Figura 1A per il diagramma di flusso.
   1. Il giorno 7, far passare le NPC utilizzando una soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) e piastrelarle a una densità di semina di 1-2 x 10⁵ cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti in un mezzo di induzione neurale caldo (37 °C) più inibitori SMAD dal kit commerciale (vedi Tabella dei materiali).
   2. L'8° giorno, preparare una soluzione di DMSO all'1% nel mezzo di differenziazione OPC e trattare gli NPC placcati per 24 ore. Il terreno di differenziazione OPC è composto da: terreno basale (DMEM/F12), integratore di N2 all'1%, integratore di B27 all'1%, fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) a 20 ng/mL, agonista levigato (SAG) a 1 μM, fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-AA) a 10 ng/mL (vedi Tabella dei materiali).
   3. Il giorno 9, sostituire il terreno con un nuovo mezzo di differenziazione OPC senza DMSO. Nutri le cellule a giorni alterni fino al giorno 15. Se le cellule raggiungono la confluenza prima del giorno 15, farle passare alla densità di semina di 1-2 x 10⁵ cellule per pozzetto, come descritto al punto 1.2.1.
   4. Il giorno 14, piastra OPC in terreno di differenziazione OPC a una densità di 1-2 x 10⁵ cellule/pozzetto in una piastra a 24 pozzetti.
   5. In questa fase (Giorno 15), testare le cellule per la presenza di marcatori specifici OPC mediante colorazione immunoistochimica (IHC) o reazione a catena della polimerasi quantitativa (qPCR) (ad esempio, O4, Olig1/2, CSPG4/Ng2, NKX2.2, PDGFRa; Figura 1B) e per l'assenza di marcatori NPC (Pax6 o Nestina; Figura 1D). In genere rileviamo l'immunoreattività dell'O4 in oltre il 95% delle cellule il giorno 15. Di particolare rilevanza per la malattia di Alzheimer, l'espressione di APP (proteina precursore dell'amiloide), BACE1 (la proteasi di elaborazione β-secretasi 1) e peptide amiloide-β (Aβ) sono abbondanti nelle OPC (Figura 1F).
3. Maturazione degli oligodendrociti (OL) (~7-20 giorni)
   1. Il giorno 15, sostituire il terreno con un terreno di maturazione OL: terreno Neurobasal-A, integratore di B27 al 2%, 1 μM di adenosina monofosfato ciclico (cAMP), 200 ng/mL di triiodotironina T3 e clemastina di 1 μM (vedere la Tabella dei materiali). Cambiare il mezzo a giorni alterni o tutti i giorni, se necessario.
   2. Quando le cellule raggiungono il 90% di confluenza, dividerle in un rapporto 1:3 fino a 2 passaggi o fino a quando la divisione cellulare non rallenta notevolmente. Se gli OPC si dividono troppo velocemente e raggiungono la confluenza in meno di 3 giorni, aggiungere Ara-C (vedi Tabella dei materiali) a una concentrazione di 2-5 μM per 1-3 giorni. La proliferazione attiva indica una minore efficienza di maturazione.
   3. Esaminare l'efficienza della maturazione oligodendrogliale valutando l'espressione dei marcatori OL, ad es. CLDN11, PLP1, MBP mediante qPCR, colorazione IHC o immunoblotting. La morfologia caratteristica di strutture altamente complesse (Figura 1C) e l'espressione di marcatori OL (Figura 1E) dovrebbero essere prontamente rilevate entro il giorno 28.

Risultati

Figura 1: generazione di iOPC (induced oligodendrocyte precursor cell) e maturazione di iOL (induced oligodendrocyte). (A) Diagramma di flusso della generazione di iOPC e iOL. (B) Immagini rappresentative in campo chiaro e in immunofluorescenza di iOPC il giorno 15. Olig2 (marcatore pan-oligodendroglia) è mostrato in verde, O4 (marcatore OPC) in rosso e DAPI in blu. ...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Accutase	Tecnologie STEMCELL	Codice: 7920
Supplemento B27	ThermoFisher	17504044
bFGF	ThermoFisher	PHG 0266
accampamento	MilliporeSigma	Codice: A9501
Clemastina	MilliporeSigma	SML0445
DMEM/F12 medio	Tecnologie STEMCELL	Telefono 36254
Dmso	ThermoFisher	D12345
Siero fetale bovino	ScienCell	10
Cellule ES umane H1	WiCell	WA01
Matrigel	Corning	354234
mTeSR plus	Tecnologie STEMCELL	Codice: 5825
Integratore N2	ThermoFisher	17502001
Neurobasale A medio	ThermoFisher	Codice 10888-022
Aminoacidi non essenziali	ThermoFisher	Codice 11140-050
PDGF-AA	Sistemi di ricerca e sviluppo	221-AA-010
pMDLg/pRRE	Addgene	Codice: 12251
Polibrene	MilliporeSigma	TR-1003-G
pRSV-REV	Addgene	Codice: 12253
Inibitore ROCK Y-27632	Tecnologie STEMCELL	Codice: 72302
abbassamento	Tocris	4366
Terreni di congelamento del progenitore neurale STEMdiff	Tecnologie STEMCELL	Codice: 5838
Kit di induzione neurale STEMdiff SMADi	Tecnologie STEMCELL	Codice: 8581
Triiodotironina T3	MilliporeSigma	T6397
Tempo-iOlogo: OPC umane derivate da iPSC	Tempo BioScience	Codice SKU102
TetO-Ng2-Puro	Addgene	Codice: 52047
VSV-G	Addgene	Codice: 12259