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1. Induzione di neuroni umani da cellule staminali pluripotenti umane
- Preparazione lentivirus (~5 giorni)
- Piastra ~ 1 milione di cellule 293T (HEK293T) del rene embrionale umano per ogni fiaschetta T75, per averle ~40% confluenti durante l'esecuzione della trasfezione. Trasfettali con plasmidi che esprimono la neurogenina 2 inducibile dalla tetraciclina (Ngn2) e il gene resistente alla puromicina (PuroR; sotto lo stesso controllo del promotore dell'operatore Tet (TetO)), il transattivatore inverso della tetraciclina (rtTA) e i tre plasmidi helper pRSV-REV, pMDLg/pRRE e VSV-G (12 μg di DNA vettore lentivirale e 6 μg di ciascuno del DNA del plasmide helper). Preparare almeno tre fiasche per ogni preparazione di lentivirus. Utilizzare la polietilenimmina (PEI) per la trasfezione seguendo le istruzioni del produttore. Sostituire il supporto dopo 16 ore e gettarlo.
- Raccogli le particelle virali rilasciate raccogliendo i terreni di coltura ogni giorno e sostituiscili con terreni freschi per 3 giorni. Raggruppare i terreni raccolti contenenti particelle virali per la purificazione. Filtrare il virus attraverso un filtro da 0,22 μm e centrifugare a 49.000 x g per 90 minuti. Risospendere il pellet nel volume appropriato di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)-glucosio (~150 μL).
- Induzione del neurone (~5 giorni)
nota: Questo protocollo di induzione (Figura 1A; diagramma di flusso) è altamente efficace sia per le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) che per le cellule staminali embrionali (ES) di pluripotenza convalidata (che possono essere analizzate mediante colorazione immunoistochimica di marcatori di pluripotenza ben caratterizzati; Figura 1B).
- Utilizzare cellule ES umane H1 disponibili in commercio al passaggio di 52 (vedi Tabella dei materiali). Coltura delle cellule su piastre a 6 pozzetti rivestite con soluzione di matrice extracellulare (~0,5 mg di soluzione di matrice per piastra a 6 pozzetti; vedere la Tabella dei materiali) utilizzando un terreno di mantenimento delle cellule ES (vedere la Tabella dei materiali) e incubare le piastre a 37 °C con il 5% di CO2.
- Il giorno -2, staccare le cellule ES (confluenti all'80%) con 1 mL di soluzione di distacco cellulare (vedere la Tabella dei materiali) e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Trasferire le cellule in una provetta; lavare il pozzetto con 2 mL di terreno e unire nella stessa provetta. Centrifugare a 300 x g per 5 minuti, risospendere il pellet in terreno e piastrare le cellule su piastre a 6 pozzetti rivestite con matrice alla densità di semina di 1 x 105 celle per pozzetto.
- Il giorno -1, aggiungere lentivirus che esprimono Ngn2 più PuroR e rtTA insieme a polibrene (8 μg/ml) alle cellule ES nel terreno di mantenimento delle cellule ES fresche (vedere la Tabella dei materiali). Il numero esatto di virus deve essere determinato dai titoli effettivi o dalla titolazione. In genere aggiungiamo 5 μl per virus per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti.
- Il giorno 0, aggiungere doxiciclina (2 μg/mL, per attivare l'espressione di Ngn2) nel terreno modificato Eagle medium/nutrient mixture F-12 (DMEM-F12) di Dulbecco con integratore di N2 senza morfogeni.
- Il giorno 1, aggiungere la puromicina in terreno fresco di DMEM-F12 più N2 e doxiciclina, alla concentrazione finale di 1 μg/mL di terreno. Selezionare le cellule trasdotte in Puromicina per almeno 24 ore. Possono essere necessarie una concentrazione più elevata di Puromicina (fino a 5 μg/mL) e un periodo di selezione più lungo (fino a 48 ore) per rimuovere adeguatamente le cellule sottotrasdotte se il titolo virale è basso.
- Il giorno 2, staccare i neuroni differenzianti con una soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) e ripiastrirli su piastre a 24 pozzetti (tra 80.000 e 200.000 cellule/pozzetto) rivestite con soluzione di matrice (vedi Tabella dei materiali) e mantenerli in terreno neurobasale A (NBA)/B27 senza doxiciclina. La densità di semina è fondamentale.
- In questa fase, i neuroni staccati possono essere congelati in un mezzo di congelamento commerciale specializzato (vedi Tabella dei materiali) e conservati in azoto liquido per un massimo di 3 mesi. I neuroni puri possono essere placcati con la tipica morte cellulare del ~15%-20% dopo il disgelo, coltivati da soli o co-coltivati con altri tipi di cellule cerebrali (vedere il passaggio 3.2.3. per la co-coltura con OPC).
- Coltura di iNs pure su piastre rivestite con soluzioni a base di matrice extracellulare come indicato dal produttore (vedere la Tabella dei materiali). La caratteristica morfologia piramidale dovrebbe essere evidente entro il Giorno 4 (e il Giorno 6; Figura 1C). La formazione di sinapsi può essere rilevata già dal giorno 14 al giorno 16 ed è prominente al giorno 24 mediante colorazione immunoistochimica con marcatori pre e post-sinaptici standard. (Figura 1D; marcato con il marcatore presinaptico Sinapsina 1 e il marcatore dendritico Map2).
2. Induzione di cellule precursori di oligodendrociti umani (OPC) da cellule staminali pluripotenti e maturazione di oligodendrociti
- Generazione di cellule progenitrici neurali (NPC): protocollo monostrato (~7 giorni). Vedere la Figura 2A per il diagramma di flusso.
- Coltivare cellule ES umane H1 come descritto in precedenza (vedere il passaggio 1.2.1.) e trans-differenziarle in cellule progenitrici neurali (NPC) con un approccio consolidato chiamato dual SMADi, con inibitori di piccole molecole per molteplici vie di segnalazione. Qui utilizziamo un kit commerciale ampiamente accettato e seguiamo il protocollo monostrato fornito dal produttore (vedi Tabella dei materiali).
- Il giorno -1, piastra 0,5-1 x 106 cellule per pozzetto in una piastra a 6 pozzetti rivestita da una soluzione di matrice ridotta con fattore di crescita (vedi Tabella dei materiali; ~0,5 mg di soluzione di matrice per piastra a 6 pozzetti) con terreno di mantenimento delle cellule ES (vedi Tabella dei materiali). Questa soluzione di matrice ridotta con fattore di crescita viene utilizzata per rivestire tutte le piastre che verranno utilizzate nelle fasi successive.
- Il giorno 0, trattare le cellule per 24 ore con un terreno di mantenimento delle cellule ES (vedere la Tabella dei materiali) integrato con il 2% di DMSO.
- Dal giorno 1 al 6, sostituire l'intero terreno con un mezzo di induzione neurale caldo (37 °C) contenente gli inibitori SMAD del kit commerciale (vedere la Tabella dei materiali). Se le cellule si dividono e raggiungono la confluenza prima del giorno 7, passatele alla densità di semina di 0,5-1 x 106, come descritto in precedenza nel passaggio 2.1.2.
- Il giorno 7, far passare le NPC utilizzando la soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) e la piastra a una densità di semina di 1-2 x 105 cellule/pozzetto di una piastra a 24 pozzetti.
- Valutare l'efficienza della differenziazione mediante colorazione immunoistochimica (IHC) per l'assenza del marcatore di pluripotenza, del fattore di trascrizione legante l'ottamero 4 (OCT4) per esempio, e della presenza di marcatori NPC come la scatola accoppiata 6 (PAX6), la nestina e il fattore di trascrizione Y-box della regione che determina il sesso 1 (Sox1).
- In questa fase, gli NPC staccati possono essere congelati nei mezzi di congelamento NPC commerciali specializzati (vedi Tabella dei materiali) e conservati in azoto liquido per un massimo di 3 mesi. Dopo il congelamento e lo scongelamento per una volta, gli NPC conservano ancora la multipotenza per dare origine a neuroni, astrociti e OPC con protocolli affidabili.
- Generazione di cellule precursori degli oligodendrociti (OPC) (~7 giorni). Si prega di consultare la Figura 2A per il diagramma di flusso.
- Il giorno 7, far passare le NPC utilizzando una soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali) e piastrelarle a una densità di semina di 1-2 x 105 cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti in un mezzo di induzione neurale caldo (37 °C) più inibitori SMAD dal kit commerciale (vedi Tabella dei materiali).
- Il giorno 8, preparare una soluzione di dimetilsolfossido all'1% (DMSO) nel mezzo di differenziazione OPC e trattare le NPC piatte per 24 ore. Il terreno di differenziazione OPC è composto da: terreno DMEM/F12, integratore di N2 all'1%, integratore di B27 all'1%, fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) a 20 ng/mL, agonista levigato (SAG) a 1 μM, fattore di crescita derivato dalle piastrine-AA (PDGF-AA) a 10 ng/mL (vedi Tabella dei materiali).
- Il giorno 9, sostituire il terreno con un nuovo mezzo di differenziazione OPC senza DMSO. Nutri le cellule a giorni alterni fino al giorno 15. Se le cellule raggiungono la confluenza prima del giorno 15, farle passare alla densità di semina di 1-2 x 105 cellule per pozzetto, come descritto al punto 2.2.1.
- Il giorno 14, piastra OPC in terreno di differenziazione OPC a una densità di 1-2 x 105 cellule/pozzetto in una piastra a 24 pozzetti.
- In questa fase (giorno 15), testare le cellule per la presenza di marcatori specifici OPC mediante colorazione IHC o qPCR (ad esempio, O4, fattore di trascrizione della linea degli oligodendrociti [Olig]-1/2, proteoglicano 4 del solfato di condroitina/antigene neurone-gliale 2 [CSPG4/Ng2[, Homeobox 2 NK2 [NKX2.2], recettore alfa del fattore di crescita derivato dalle piastrine [PDGFRa]; Figura 2B) e per l'assenza di marcatori NPC (Pax6 o Nestina; Figura 2D). In genere rileviamo l'immunoreattività dell'O4 in oltre il 95% delle cellule al giorno 15. Di particolare rilevanza per la malattia di Alzheimer, l'espressione di APP (proteina precursore dell'amiloide), BACE1 (la proteasi di elaborazione β-secreatasi 1) e peptide amiloide-β (Aβ) è abbondante nelle OPC (Figura 2F).
3. Co-coltura di neuroni indotti umani (iN) e cellule precursori di oligodendrociti (iOPC)
- Placcatura iOPC (~3 giorni)
- Piastra iOPC al giorno 14 a una densità di 1 x 105 cellule per pozzetto in una piastra a 24 pozzetti (come descritto sopra al passaggio 2.2.4.) in mezzo di differenziazione OPC (come descritto al passaggio 2.2.2.).
- Configurazione della co-coltura iN-iOPC
- Il giorno 15, staccare i neuroni umani indotti nella fase del giorno 2 dopo la selezione della puromicina (come descritto nella fase 1.2.6.) con la soluzione di distacco cellulare (vedi Tabella dei materiali).
- Aggiungere neuroni sulle OPC in coltura, piastrando alla densità di semina di 2 x 105 cellule per pozzetto nella piastra a 24 pozzetti con OPC in crescita (dal passaggio 3.1.1). Utilizzare il terreno di co-coltura contenente terreno Neurobasal-A, integratore di B27 al 2% e 100 ng/mL di triiodotironina T3. Cambiare il mezzo il giorno successivo e poi a giorni alterni. Se gli OPC proliferano troppo velocemente e raggiungono la confluenza in meno di 3 giorni, aggiungere citosina arabinoside (Ara-C) a una concentrazione di 2-5 μM. Un'immagine rappresentativa degli iN e degli iOPC cresciuti in co-coltura dopo 7 giorni di neuroni è mostrata nella Figura 3A.
- Utilizzare neuroni congelati preparati come descritto sopra nel passaggio 1.2.7 per la co-coltura con OPC. Piastra di congelamento e scongelamento dei neuroni a una densità più elevata di 3 x 105 cellule per pozzetto.
- Dopo il giorno 14-16 nelle co-colture, la formazione di sinapsi negli iNs può essere osservata mediante colorazione IHC dei marcatori pre e post-sinaptici, ed entro il giorno 21 i punti sinaptici dovrebbero essere abbondanti (Figura 3C) e le attività neuronali possono essere registrate in modo affidabile.
- A partire dal giorno 21, testare le cellule per marcatori specifici dell'OL (ad esempio, la proteina basica della mielina [MBP] e la proteina proteolipide 1 [PLP1]). Al giorno 28, normalmente osserviamo il fenomeno dell'inguaina degli assoni iN da parte dei processi iOL, marcati mediante colorazione IHC per marcatori specifici (Figura 3B; neurofilamento [NF] per gli assoni iN e MBP per i processi iOPC).
