1. Preparazione sperimentale
- Preparare piastre rivestite con matrice a membrana basale (BMM).
nota: Il BMM si solidifica più rapidamente a temperature più calde. Le piastre devono essere preparate rapidamente e immediatamente poste a 4 °C per la conservazione.
- Scongelare il BMM (vedi Tabella dei materiali) su ghiaccio, a 4 °C per almeno 2 ore, o durante la notte.
- Miscelare il Modified Eagle Medium (DMEM)/F12 e BMM di Dulbecco fino a una concentrazione finale di 80 μg/mL. Distribuire la soluzione di BMM in piastre per colture tissutali (1 mL per piastre da 35 mm e 2 mL per piastre da 60 mm) e incubare a 37 °C per almeno 1 ora o durante la notte prima di piastrare.
NOTA: Le stoviglie non utilizzate possono essere conservate a 4 °C per 2 settimane.
- Preparare piastre rivestite di poli-L-ornitina/laminina (PLO/laminina).
- Preparare 20 μg/mL di PLO (vedere la Tabella dei materiali) in soluzione salina sterile tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS+/+) e aggiungere 1 mL a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare per una notte a 37 °C nell'incubatore.
- Il giorno seguente, aspirare il PLO con un aspiratore a vuoto e lavare due volte con DPBS+/+. Asciugare all'aria nel cappuccio.
NOTA: Le piastre essiccate all'aria possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane, avvolte in un foglio di alluminio, per un uso futuro.
- Preparare 10 μg/mL di laminina (vedere la Tabella dei materiali) in DPBS+/+ e aggiungere 1 mL a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Incubare per almeno 3 ore o per una notte a 37 °C nell'incubatore.
- Aspirare la laminina con un aspiratore a vuoto e aggiungere 1 mL di DPBS+/+.
NOTA: Il rivestimento di laminina non deve asciugarsi. Per evitare che ciò accada, è necessario aggiungere immediatamente il PBS o un terreno di coltura appropriato. Le piastre rivestite possono essere conservate a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
- Preparare la soluzione di passaggio PSC.
- Sciogliere 11,49 g di cloruro di potassio (KCl) e 0,147 g di citrato di sodio diidrato (HOC(COONa) (CH2COONa)2*2H2O) in 400 mL di acqua sterile per colture cellulari (vedere la Tabella dei materiali).
- Misurare il volume della soluzione e registrarlo come volume iniziale (Vi).
- Misurare l'osmolarità e regolarla a 570 mOsm aggiungendo acqua sterile per colture cellulari utilizzando la formula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
- Sterilizzare la soluzione con un filtro da 0,20 μm e fare aliquote da 10 mL. Conservare le aliquote a temperatura ambiente (RT) per un massimo di 6 mesi.
- Preparare cellule staminali pluripotenti (PSC) medium.
NOTA: le iPSC sono mantenute in un terreno contenente il fattore di crescita dei fibroblasti 2 (FGF2) stabile al calore (vedi Tabella dei materiali), fornendo un programma di alimentazione senza fine settimana. Altri supporti PSC disponibili in commercio non sono stati provati per questo protocollo.
- Scongelare l'integratore di PSC medium per una notte a 4 °C.
- Aggiungere 10 mL di integratore di terreno PSC a 500 mL di terreno PSC basale. Preparare aliquote da 25 mL e conservare a −20 °C.
NOTA: Le aliquote congelate possono essere conservate a -20 °C per 6 mesi. Le aliquote scongelate devono essere conservate a 4 °C e utilizzate entro 2 settimane. Le cellule possono essere congelate per la conservazione a lungo termine in un terreno PSC con il 10% (v/v) di dimetilsolfossido (DMSO).
- Preparare il mezzo di scongelamento PSC.
- Integrare il terreno PSC con 50 nM di chroman, 1,5 μM di emricasan, 1 integratore di poliammine e 0,7 μM di trans-ISRIB (cocktail CEPT) (vedere la Tabella dei materiali).
- Sterilizzare con un filtro da 0,20 μm e conservare a 4 °C per un massimo di 4 settimane.
- Preparare le pipette di vetro estratte.
- Tirare le pipette di vetro Pasteur da 22,9 cm (9 pollici) in due pezzi sopra un bruciatore Bunsen, ~2 cm sotto il collo, creando due pipette, con il lato più sottile che è ~4 cm più corto dell'altro.
- Con l'aiuto della fiamma, piegare le punte del lato tirato per creare una "r" liscia.
- Posizionare le pipette estratte nei manicotti dell'autoclave e nell'autoclave per la sterilizzazione.
- Preparare il terreno di differenziazione cerebellare (CDM).
- Mescola il Dulbecco's Medium modificato (IMDM) di Iscove e il mix di nutrienti F12 di Ham in un rapporto 1:1. Integrare la miscela con 1x integratore di L-alanina-L-glutammina, 1% (v/v) di concentrato lipidico chimicamente definito, 0,45 mM di 1-tio-glicerolo, 15 μL/mL di apo-transferrina, 5 mg/mL di albumina sierica bovina (BSA) e 7 μg/mL di insulina (vedi Tabella dei materiali).
- Sterilizzare con un filtro da 0,20 μm, conservare a 4 °C e utilizzare entro 1 mese.
- Preparare il terreno di maturazione cerebellare (CMM).
- Integrare il terreno neurobasale con 1x integratore di L-alanina-L-glutammina e 1x integratore di N-2 (vedi Tabella dei materiali).
- Sterilizzare con un filtro da 0,20 μm, conservare a 4 °C e utilizzare entro 2 settimane.
2. Cultura iPSC senza alimentatore
- Scongelare le celle seguendo i passaggi seguenti.
- Posizionare una piastra BMM (passaggio 1.1) nell'incubatore a 37 °C per gelificare per almeno 1 ora o durante la notte prima di scongelare le cellule.
- Preriscaldare 10 mL di terreno di scongelamento PSC (fase 1,5) a 37 °C.
- Trasferire il crioviale con cellule da azoto liquido a bagnomaria a 37 °C.
NOTA: Per evitare di generare una fonte di contaminazione nello spazio di coltura cellulare, si sconsiglia l'uso di un bagnomaria standard. Al contrario, l'acqua dolce può essere riscaldata in un piccolo becher a 37 °C per generare un bagno d'acqua monouso.
- Quando è rimasto un piccolo pezzo di ghiaccio nel tubo, rimuoverlo dal bagnomaria, asciugare il tubo e spruzzare con etanolo al 70%. Trasferire la provetta nella cappa e utilizzare una pipetta sierologica da 2 mL o 5 mL (vedere la Tabella dei materiali) per trasferire delicatamente le cellule in una provetta conica da 15 mL.
- Aggiungere 8 mL di terreno di scongelamento PSC alle cellule facendo roteare la provetta conica. Centrifugare a 200 x g per 5 min a RT.
- Aspirare con cura il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il pellet della cella. Risospendere le cellule in 2 mL di terreno di scongelamento PSC.
- Aspirare il BMM dalla piastra e aggiungere le cellule risospese a goccia su tutta la piastra per una distribuzione uniforme.
- Posizionare la piastra nell'incubatore a 37 °C, 5% CO2. Rinfrescare il terreno il giorno successivo con PSC medium. Dopodiché, cambia il mezzo ogni giorno.
- Mantenere le celle seguendo i passaggi seguenti.
- Preriscaldare il volume necessario di terreno PSC a 37 °C (ad esempio, 1 mL di terreno per piastra da 35 mm).
- Esaminare le piastre per le cellule differenziate o le colonie e rimuovere le cellule differenziate con una pipetta di vetro tirata (passaggio 1.6).
NOTA: le colonie di iPSC hanno bordi lisci con cellule morfologicamente identiche.
- Cambiare il mezzo speso giornalmente e passare ogni 3-4 giorni o quando si raggiunge il 70% di confluenza.
- Passaggio delle celle.
- Mettere la quantità necessaria di piastre BMM nell'incubatore per almeno 1 ora o durante la notte prima di passare. Preriscaldare la quantità necessaria di terreno PSC (fase 1.3) a 37 °C.
- Utilizzando una pipetta di vetro estratta, pulire eventuali cellule o colonie differenziate.
- Aspirare il terreno esaurito con un aspiratore a vuoto e aggiungere il terreno di dissociazione PSC, 1 mL per piatto da 35 mm. Incubare a 37 °C per 1-3 min.
NOTA: Se le colonie si staccano nella soluzione di passaggio PSC prima di aggiungere il terreno PSC, il tempo di incubazione può essere ridotto.
- Aspirare la soluzione di passaggio PSC e aggiungere il terreno PSC preriscaldato.
- Utilizzando un puntale per pipetta sterile da 200 μl, graffiare le linee parallele tra loro in una direzione, ruotare la piastra di 90° e creare una seconda serie di linee di graffio perpendicolari alle precedenti (creando un motivo a tratteggio incrociato sulla piastra).
- Aspirare la soluzione BMM dalle piastre di fissaggio. Raccogli le colonie utilizzando una pipetta sierologica e distribuiscile su nuove piastre BMM.
- Incubare a 37 °C, 5% CO2. Cambia il mezzo ogni giorno.
- Congelare le cellule.
- Preparare i crioviali etichettando il contenuto e sterilizzare sotto la luce ultravioletta (UV) nella cappa (vedi Tabella dei materiali) per 30 minuti.
- Preparare il terreno di congelamento PSC integrando il terreno PSC con DMSO al 10% (v/v). Segui i passaggi 2.3.2-2.3.5.
- Trasferire le cellule in una provetta conica da 15 mL con una pipetta sierologica da 5 mL e centrifugare a 200 x g per 5 minuti a RT.
- Aspirare con cautela il terreno e risospendere il pellet di cella nel mezzo di congelamento PSC.
- Distribuire in crioviali. Mettere i flaconcini in un contenitore di congelamento e mettere il contenitore in un congelatore a -80 °C.
- Il giorno seguente, trasferire i crioviali in azoto liquido per la conservazione a lungo termine.
3. Differenziazione cerebellare
NOTA: Prima di iniziare la differenziazione, le iPSC vengono passate a sei piastre da 35 mm e sono pronte per la differenziazione quando sono al 70% di confluenza. Ogni piastra da 35 mm verrà trasferita in un pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
- Il giorno 0, sollevare le colonie sane di iPSC per la formazione di EB.
- Aggiungere 1 mL di CDM (fase 1.7) integrato con 10 μM di Y-27632 e 10 μM di SB431542 (vedere la Tabella dei materiali) a ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti con attacco ultra-basso (ULA) e collocarlo nell'incubatore fino a quando le colonie sollevate non sono pronte per essere aggiunte ai pozzetti.
- Pulire le cellule differenziate utilizzando una pipetta di vetro estratta. Aspirare il terreno e aggiungere 1 mL di soluzione per passaggio PSC per ogni piatto da 35 mm. Incubare per 3 minuti a 37 °C, aspirare e aggiungere 2 mL di CDM integrati con 10 μM di Y-27632 e 10 μM di SB431542,
nota: Se le colonie si staccano nella soluzione di passaggio PSC prima di aggiungere il CDM, il tempo di incubazione può essere ridotto.
- Sotto un microscopio invertito a luce trasmessa, sollevare delicatamente le colonie utilizzando il bordo piegato della pipetta di vetro estratta con un ingrandimento 4x. Una volta sollevata ogni colonia, trasferire delicatamente il tutto in un pozzetto della piastra ULA a 6 pozzetti utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL. Ripetere questo processo per ogni piastra iPSC. Incubare le cellule a 37 °C con CO2,
nota: Se le colonie sono troppo grandi o sono unite, possono essere affettate con la punta della pipetta di vetro tirata per creare EB più piccoli.
- Il giorno 2, aggiungere FGF2 a ciascun pozzetto fino a una concentrazione finale di 50 ng/mL.
nota: L'FGF2 utilizzato per la differenziazione cerebellare non è stabile al calore. Questo protocollo non è stato testato con FGF2 termostabile.
- Il giorno 7, fai un cambio medio di 1/3. Per 3 mL di terreno totale in un pozzetto, con un pipettatore da 1.000 μL, aspirare delicatamente 1 mL di terreno esaurito e sostituirlo con 1 mL di CDM fresco. Incubare gli EB per 7 giorni.
- Il giorno 14, aspirare delicatamente quasi tutto il terreno esaurito utilizzando un pipettatore da 1.000 μl. Per garantire il minimo danno agli EB, agitare la piastra per raccogliere tutti gli EB al centro della piastra, quindi inclinare la piastra e aspirare lentamente dal bordo.
- Man mano che la quantità media diminuisce, stendere lentamente la piastra e continuare ad aspirare. Lasciare abbastanza terreno per evitare che gli EB si secchino. Successivamente, aggiungere 3 mL di CDM fresco integrato con 10 μM di Y-27632. Trasferire gli EB utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL in una piastra rivestita di PLO/laminina (fase 1.2).
nota: A seconda dell'applicazione a valle, gli EB possono essere trasferiti a una piastra PLO/laminina a 6 pozzetti o singoli EB possono essere trasferiti a un singolo pozzetto di una piastra a 24 pozzetti rivestita di PLO/laminina o di un vetrino coprioggetti.
- Il giorno 15, aspirare il terreno e sostituirlo con CDM.
fresco
nota: È importante aggiungere una quantità sufficiente di terreno ai pozzetti per garantire una quantità sufficiente di terreno tra una poppata e l'altra poiché, nel tempo, si verificherà un'evaporazione (ad esempio, per un pozzetto in una piastra a 6 pozzetti, aggiungere 3 ml di terreno). Se il terreno ha iniziato ad acidificarsi (diventa chiaro e giallo), rinfrescare il terreno anche se non è nel programma di alimentazione fino alla fine del protocollo.
- Il giorno 21, aspirare il terreno di coltura esaurito e sostituirlo con una CMM. Il giorno 28, sostituire il fluido con una CMM fresca. Il giorno 35, raccogliere le cellule per ulteriori applicazioni.
