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1. Differenziazione HiPSC in neuroni misti e glia
NOTA: La procedura richiede circa 28 giorni per essere completata, con i passaggi principali descritti nella Figura 1.
- Generazione di corpi embrioidi (EB) (Giorni 0 → 1)
NOTA: Questa procedura richiede una buona manualità e precisione. I frammenti di colonie di HiPSC (cellule staminali pluripotenti indotte umane) dovrebbero essere di dimensioni uguali per ottenere corpi embrioidi omogenei (EB) nelle fasi successive. Le colonie morfologicamente differenziate (con grandi frazioni citoplasmatiche e piccoli nucleoli) devono essere scartate.
- Rinfrescare il terreno hiPSC (piastra di Petri da 3 mL/60 mm) prima di tagliare le colonie di hiPSC indifferenziate (circa 1 mm di diametro, vedere la Figura 2A) in condizioni sterili.
- Tagliare le colonie indifferenziate (come mostrato nella Figura 2A e nella Figura 2B) in frammenti di circa 200 μm x 200 μm utilizzando una siringa da 1 ml con un ago da 30 G. Utilizzare un microscopio stereoscopico con ingrandimento 4X in una cappa a flusso laminare a temperatura ambiente.
- Staccare i frammenti di colonia dalla superficie della piastra utilizzando una pipetta da 200 μl pipettando delicatamente il terreno sottostante per sollevare i pezzi.
- Trasferire tutti i frammenti staccati e il terreno in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 ml.
- Sciacquare la capsula con 2 ml di terreno hiPSC completo per recuperare tutti i frammenti.
- Centrifugare a 112 x g per 1 min.
- Aspirare il surnatante e risospendere delicatamente i frammenti in 5 mL di terreno completo di hiPSC EB (vedere la Tabella dei Materiali).
- Piastra i frammenti di colonia in una piastra di Petri da 60 mm a bassissimo attacco (piastra di Petri da 5 ml/60 mm).
- Incubare la capsula di Petri per una notte a 37 °C e 5% di CO2.
- Il giorno successivo (Giorno 1), raccogliere gli EB e il loro terreno in una provetta da 15 ml utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 ml.
- Centrifugare gli EB a 112 x g per 1 min.
- Aspirare con cautela il surnatante e risospendere delicatamente gli EB in 5 mL di terreno EB hiPSC completo utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 mL.
- Riplaccare gli EB su una nuova piastra Petri ultra-bassa da 60 mm (piastra Petri da 5 mL/60 mm).
- Incubare la capsula di Petri per una notte a 37 °C e 5% di CO2.
- Il giorno 1, rivestire le piastre con la matrice della membrana basale (ad es. matrigel, di seguito denominata "matrice standard") o qualsiasi altro substrato proteico adatto (ad es. laminina).
- Conservare la matrice standard (vedere la Tabella dei materiali) a -80 °C in aliquote da 200 μL utilizzando provette fredde da 1,5 mL e pipette fredde da 5 o 10 mL.
- Scongelare 200 μL di matrice standard su ghiaccio.
- Diluire 200 μL di matrice standard in 20 mL di terreno basale (DMEM/F12) (diluizione 1:100).
- Rivestire piastre di Petri da 60 mm con questa soluzione (5 mL/piastra).
- Incubare le piastre rivestite a 37 °C per una notte.
nota: Questi piatti saranno utilizzati per impiattare gli EB (circa 50 EB/piatto) e generare aggregati neuroepiteliali (rosette); Vedere il passaggio 1.3.
- Generazione di aggregati neuroepiteliali (rosette) (Giorni 2 → 7)
- Il giorno 2, rimuovere la soluzione standard di rivestimento della matrice dalle piastre di Petri da 60 mm (non è necessario risciacquare le piastre) e riempirle con 5 mL/piastra di terreno completo di induzione neuroepiteliale (NRI); vedere la Tabella dei materiali.
- Trasferire gli EB flottanti (dal passaggio 1.1.14) in piastre rivestite (~50 EB/piatto) utilizzando una pipetta da 200 μL al microscopio stereoscopico con ingrandimento 4x e posizionate in una cappa a flusso laminare.
nota: È fondamentale selezionare EB omogenei e di medie dimensioni (~200-300 μm di diametro). Gli EB troppo piccoli possono non sopravvivere bene durante la differenziazione neuroectodermica, mentre gli EB troppo grandi tendono a subire necrosi centrale.
- Incubare le piastre a 37 °C e 5% di CO2.
- Il giorno dopo (Giorno 3), controllare le piastre al microscopio con un ingrandimento di 10x per assicurarsi che gli EB siano tutti collegati.
- Eseguire delicatamente un cambio totale del terreno con un mezzo NRI completo.
- Cambiare il mezzo NRI a giorni alterni fino al giorno 7, quando gli aggregati neuroepiteliali (rosette) dovrebbero essere visibili.
- Il giorno 7, rivestire la matrice standard (o laminina), come descritto al punto 1.2, su qualsiasi piatto o formato di piastra richiesto: piastre a 96 pozzetti (100 μL/pozzetto), piastre a 24 pozzetti (250 μL/pozzetto), piastre a 12 pozzetti (500 μL/pozzetto), chip MEA (per attività elettrica, 1 mL/chip a pozzetto singolo) o piastre Petri da 60 mm (4 mL/piastra).
- Incubare le piastre/piastre rivestite per almeno 2 ore a 37 °C e 5% di CO2.
- Dissociazione della rosetta e differenziazione neuronale (Giorni 8 → 28)
NOTA: Questa procedura richiede una buona manualità e precisione. Per evitare di raccogliere cellule mesodermiche ed endodermiche, devono essere dissociate e raccolte solo le strutture simili a rosetta dell'ectoderma.
- L'ottavo giorno, tagliare le strutture a rosetta in frammenti al microscopio stereoscopico con ingrandimento 10X in condizioni sterili. Utilizzare una siringa da 1 ml con un ago da 30 G. Si noti che le rosette tendono a staccarsi facilmente dal piatto quando vengono toccate con l'ago.
- Completare il distacco dei frammenti di rosetta utilizzando una pipetta da 200 μl.
- Trasferire la piastra sotto la cappa a flusso laminare e raccogliere i frammenti di rosetta e il loro terreno in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta da 1, 2 o 5 mL. Sciacquare la piastra con 2 ml di terreno NRI per recuperare tutti i frammenti.
- Centrifugare i frammenti di rosetta a 112 x g per 2 min.
- Aspirare il surnatante.
- Risospendere delicatamente il pellet in 1 mL di 1x DPBS (senza calcio e magnesio) e pipettare delicatamente i frammenti di rosetta su e giù utilizzando una pipetta da 1.000 μL per dissociarli parzialmente.
- Aggiungere 4 mL di terreno NRI completo e contare le cellule utilizzando il blu di tripano e un contatore automatico di cellule (vedere la Tabella dei materiali)
nota: Diluire 20 μl di sospensione cellulare in 20 μl di blu di tripano. Questo passaggio può essere omesso se le cellule non possono essere portate in una sospensione a cellula singola. Se i frammenti di rosetta non sembrano completamente dissociati, i frammenti di rosetta derivati da circa 50 EB/piastra da 60 mm possono essere risospesi in 50 mL di terreno NRI completo e placcati, come indicato nella Tabella 1.
- Aspirare la soluzione di rivestimento della matrice standard (o laminina) dalle piastre di Petri, dalle piastre e/o dai chip MEA (dal passaggio 1.3.7). Non lasciarli asciugare.
- Placcare le cellule in un mezzo NRI completo secondo il piano di studio (circa 15.000 cellule/cm2; vedere la Tabella 1 per le indicazioni del volume di placcatura).
- Incubare le piastre per una notte a 37 °C e 5% di CO2.
- Il giorno 10, eseguire un cambio totale del mezzo utilizzando un mezzo di differenziazione neuronale completo (ND); vedere la Tabella dei Materiali.
- Aggiornare il terreno ND completo due volte a settimana fino al giorno 28.
Tabella 1.
Nota sulla densità di placcatura della rosetta dissociata: se i frammenti di rosetta non appaiono completamente dissociati, per raggiungere una densità di placcatura cellulare di circa 15.000 cellule/cm2, i frammenti di rosetta dissociati derivanti da circa 50 EB/1 x 60mm-piatto possono essere risospesi in 50 mL di terreno NRI completo e placcati come segue (a seconda del formato della piastra):
| Piastre multipozzetto / MEA | Area di crescita (cm2/pozzetto) | Volume della sospensione della cella alla piastra per pozzetto (o chip MEA) | Numero massimo di piastre che possono essere piastrate (con 50 ml di sospensione cellulare) |
| 96 pozzi | 0,3 | 100 ul | 5 |
| 48 pozzetti | 0,7 | 220 ul | 4 |
| 24 pozzetti | numero arabo | 625 ul | 3 |
| 12 pozzetti | 4 | 1,25 ml | 3 |
| 6 pozzetti | 10 | Flacone da 3,125 ml | numero arabo |
| Chip MEA a pozzetto singolo | 3.5 | Flacone da 1,1 ml | 45 |
