Tutte le procedure che coinvolgono modelli animali sono state esaminate dal comitato istituzionale locale per la cura degli animali e dal comitato di revisione veterinaria JoVE.
1. Dissociazione delle cellule ventrali del mesencefalo
- Trasferire i pezzi del mesencefalo ventrale sotto una cappa a flusso laminare. Rimuovere la soluzione salina bilanciata di Hanks (HBSS) e aggiungere 1 ml di acido preriscaldato (37 ºC) allo 0,05% di tripsin-etilendiamminotetraacetico (tripsina-EDTA) nel tubo conico (volumi sufficienti per un massimo di 12 pezzi di mesencefalo ventrale). Incubare il tessuto a 37 ºC per 5-10 minuti.
- Rimuovere la tripsina-EDTA sotto il cappuccio e aggiungere 1 ml di terreno di disattivazione (il siero disattiva la tripsina) al tessuto.
- Rimuovere il mezzo di disattivazione e lavare il fazzoletto in 1 ml del mezzo completo due volte.
nota: Per evitare di scartare le cellule dissociate, evitare di rimuovere tutto il terreno dal tubo e di pipettare il tessuto.
- Aggiungere 1 ml di terreno completo e triturare il fazzoletto con una pipetta di vetro lucidata a fuoco. Evitare la formazione di bolle e continuare la triturazione fino a ottenere una sospensione a cella singola.
NOTA: Di solito, sono necessari 8-10 passaggi attraverso la punta ristretta per la dissociazione completa.
- Centrifugare le celle a 400 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT) e rimuovere il terreno.
- Risospendere il pellet in 1 ml di terreno completo pipettandolo lentamente verso l'alto e verso il basso fino a quattro volte.
2. Placcatura delle cellule del mesencefalo ventrale
- Mescolare 10 μl della sospensione cellulare con 90 μl di soluzione di blu di tripano e contare il numero di cellule con un emocitometro.
nota: In questa fase è possibile verificare anche la vitalità delle cellule.
- Posizionare i tappi delle provette sterilizzate per microcentrifuga in piastre di Petri da 100 mm e trasferire i vetrini coprioggetti rivestiti di poli-L-ornitina/laminina, utilizzando una pinza, uno alla volta sopra i tappi.
nota: Non lavare i vetrini coprioggetti ed evitare di asciugare la laminina, poiché ciò potrebbe causare colture irregolari e ridurre la sopravvivenza delle cellule.
- Regolare il volume a 1.500 cellule per 1 μl aggiungendo un terreno completo e 100 μl (totale di 150.000 cellule) di sospensione cellulare sopra ogni vetrino coprioggetti (il volume è ottimale per coprire la superficie del vetrino coprioggetti senza fuoriuscite). Chiudere le piastre di Petri e incubarle per 1 ora in un incubatore di coltura tissutale umidificato (37 °C, 5% CO2).
nota: FASE CRITICA: Questa fase è necessaria per migliorare l'attaccamento e la vitalità delle cellule e per aumentare il numero di vetrini coprioggetti per embrione. In alternativa, le cellule possono essere trasferite direttamente nei pozzetti (contenenti vetrini), ma il numero di cellule dovrebbe essere aumentato a 350.000 per pozzetto (invece di 150.000). In altre parole, utilizzando questo metodo, è possibile acquisire 8-10 vetrini coprioggetti, mentre il trasferimento diretto produce circa 3-4 vetrini coprioggetti a causa delle cellule che si attaccano alle piastre (accanto o sotto i vetrini). La vitalità media delle colture che utilizzavano questo metodo era di circa il 90%.
3. Crescita e mantenimento della cultura
- Dopo 1 ora di incubazione, trasferire con cura i vetrini, compreso il terreno, in piastre a 24 pozzetti contenenti 400 μl di terreno completo preriscaldato (a 37 ºC) (volume totale: 500 μl). Incubare le cellule per una notte (O/N) a 37 ºC.
- Entro 24 ore dall'incubazione dei pozzetti, aggiungere delicatamente 500 μl di terreno completo in ciascun pozzetto.
NOTA: Le prime ore sono la fase più critica per la sopravvivenza dei neuroni dopaminergici e il numero di cellule sopravvissute non cambia significativamente oltre questo punto.
- Non aggiungere altri terreni alle colture per le prime due settimane o fino a quando il terreno non diventa giallo. Se la coltura dura più di due settimane o il colore del terreno diventa giallo, sostituire metà del terreno (500 μl) con un terreno fresco e preriscaldato completo (in genere ogni due settimane).
nota: I neuroni dopaminergici all'interno delle colture sopravviverebbero per più di sei settimane in queste condizioni.
