Tutte le procedure che coinvolgono partecipanti umani sono state eseguite in conformità con le linee guida istituzionali, nazionali e internazionali per il benessere umano e sono state esaminate dal comitato di revisione istituzionale locale.
1. Ottenere campioni di tessuto
NOTA: Una componente fondamentale di questo protocollo richiede una corretta gestione della donazione di tessuto a partire immediatamente dal momento dell'autopsia. La vitalità complessiva del campione dipende in modo significativo dalla riduzione al minimo dell'intervallo post-mortem (PMI), dal trasferimento immediato del tessuto nel mezzo freddo appropriato integrato con antibiotici/antimicotici, dal mantenimento del campione su ghiaccio umido durante il trasporto e dal mantenimento della tecnica sterile per tutta la durata del protocollo.
- Alla notifica di una donazione imminente, preparare un kit di raccolta dei campioni. Utilizzando una scatola di spedizione con un contenitore isolato che può essere utilizzato direttamente per il trasporto di ritorno del campione di tessuto, includere i seguenti materiali:
- Includi materiali per la preparazione sterile, inclusi guanti, teli e bisturi sterili.
- Includere 8 - 10 provette coniche sterili da 50 mL contenenti 30 mL di terreno di spedizione nel contenitore isolato con ghiaccio o impacchi freddi.
nota: Sebbene qualsiasi terreno di coltura cellulare standard possa funzionare, la migliore vitalità del campione si ottiene con Hibernate-A integrato con antibiotici/antimicotici.
- Includere eventuali ulteriori provette per altre analisi (ad es. fissativi).
- Se l'autopsia non verrà eseguita presso la sede dello sperimentatore, allegare un documento che indichi chiaramente come raccogliere il campione di tumore. Ciò include dettagli come il mantenimento della sterilità, la conservazione delle provette dei campioni sul ghiaccio umido e l'inclusione di campioni dal mesencefalo e dal midollo poiché le cellule tumorali spesso invadono queste regioni.
- Mantenere la sterilità durante l'autopsia. Considera il cervello sterile all'interno del cranio, quindi osserva la tecnica sterile (incluso il cambio dei guanti) una volta che il cranio è aperto. Evitare la contaminazione con pelle e capelli è fondamentale.
- Sezionare il tumore dal lato ventrale (il "ventre" del ponte, vedi Figura 1). Con un bisturi sterile, tagliare piccoli pezzi di 1 cm dal tumore e trasferirli immediatamente in un terreno di spedizione freddo (vedere NOTA al passaggio 1.1.2) e mettere su ghiaccio umido. Inserire 10 mL di tessuto in ciascuna provetta, ottenendo un volume finale di tessuto e terreno in ciascuna provetta di 40 mL.
nota: Nel caso del glioma pontino intrinseco diffuso (DIPG), il tumore si infiltra diffusamente nel ponte e frequentemente nel resto del tronco encefalico. Pertanto, raccogliere la maggior parte possibile del campione, in genere includendo 3-4 provette (30-40 mL di tessuto) dal ponte e 1-2 provette (10-20 mL di tessuto) ciascuna dal mesencefalo e dal midollo.
- Raccogli campioni dal mesencefalo e dal midollo giustapposti al ponte, che spesso contengono molte cellule tumorali.
- Dopo la raccolta del campione, spedire i campioni durante la notte (O/N) su ghiaccio umido nel contenitore isolato. Non spedire il campione su ghiaccio secco, poiché il congelamento ucciderà le cellule.
2. Preparazione per l'elaborazione dei campioni
- Prima di iniziare la preparazione del campione, sterilizzare le cappe di coltura tissutale insieme a lame di rasoio, emostatici curvi e qualsiasi altro strumento non sterile sotto la luce ultravioletta (UV) per 1 ora. Eseguire tutti i seguenti passaggi in condizioni sterili per prevenire la contaminazione delle colture.
- Preparare e sterilizzare le soluzioni filtranti.
- Per preparare la soluzione di saccarosio 1,8 M, sciogliere 308,07 g di saccarosio in 300 ml di acqua distillata. Aggiungere 50 mL di 10 mL di soluzione salina tamponata di Hank (HBSS) senza calcio o magnesio e portare il volume totale a 500 mL utilizzando acqua distillata. Conservare a 4 °C.
- Per preparare la soluzione di digestione enzimatica, assumere 50 mL di HBSS con calcio e magnesio per ogni 10 mL di tessuto tritato e aggiungere 500 μL 5 mg/mL di desossiribonucleasi I (concentrazione finale 50 μg/mL), 500 μL 2,5 mg/mL di collagenasi I/II e soluzione di dispasi (concentrazione finale 25 μg/mL), e 500 μl di tampone di acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetanosolfonico (HEPES) da 1 m. Preriscaldare la soluzione di digestione a bagnomaria a 37 °C.
- Per preparare la base del terreno di derivazione tumorale (TSM), mescolare 250 mL di Neurobasal-A, 250 mL di Dulbecco's Modified Eagle Medium: Miscela di nutrienti F12 (DMEM/F12), 5 mL di antibiotico-antimicotico 100x, 5 mL di L-alanil-L-glutammina dipeptide (GlutaMAX-A) da 200 mM, 5 mL di tampone HEPES, 5 mL di piruvato di sodio da 100 mM e 5 mL di aminoacidi non essenziali 100x MEM.
- Per preparare un TSM completo con fattori di crescita, aggiungere i seguenti integratori alla base TSM: 50x B27 Supplement Minus Vitamin A (1:50), Fattore di crescita epidermico umano (H-EGF, 20 ng/mL), Fattore di crescita dei fibroblasti umani (H-FGF, 20 ng/mL), Fattore di crescita umano derivato dalle piastrine AA (H-PDGF-AA, 10 ng/mL), Fattore di crescita umano derivato dalle piastrine BB (H-PDGF-BB, 10 ng/mL) e soluzione di eparina (2 μg/mL).
- Preraffreddare a 4 °C una centrifuga da laboratorio dotata di rotore a secchiello oscillante.
3. Dissociazione meccanica
- Trasferire il tessuto in una piastra per colture cellulari ad alta parete di 100 mm x 20 mm. Rimuovere i terreni rimanenti dalla spedizione e sostituirli con 10 - 15 ml di terreno di coltura a freddo.
- Usando gli emostatici curvi per afferrare una lama di rasoio, tritare finemente il tessuto rimuovendo i vasi sanguigni evidenti o le meningi.
nota: I frammenti di tessuto finali devono essere più piccoli di 1 mm (vedi Figura 2B).
- Trasferire il fazzoletto in una provetta conica pulita da 50 mL. Lavare la piastra di coltura cellulare con altri 5 mL di terreno di coltura fredda e trasferirla nella provetta conica. Ripetere questa fase di lavaggio se necessario per trasferire il tessuto rimanente.
- Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, triturare delicatamente (4 - 5 volte). Lasciare che i frammenti di tessuto più grandi si depositino sul fondo del tubo. Se necessario, centrifugare brevemente il campione per 1 minuto (350 x g, 4 °C).
- Raccogli la frazione meccanicamente dissociata.
- Rimuovere il surnatante e filtrarlo attraverso un filtro da 100 μm in una nuova provetta conica da 50 mL etichettata come "Dissociazione meccanica". Capovolgere il filtro sulla provetta conica originale e lavare con terreno di coltura per recuperare i frammenti di tessuto.
- Centrifugare la frazione di "Dissociazione Meccanica" per 5 min (350 x g, 4 °C).
- Rimuovere il surnatante dalla frazione pellettata di "dissociazione meccanica" e risospendere il tessuto in terreni di coltura freddi. Se nella provetta conica di "Dissociazione meccanica" sono presenti più di 5 mL di tessuto, dividere il tessuto in altre provette coniche da 50 mL in modo che nessuna provetta abbia più di 5 mL di tessuto.
- Conservare la frazione dissociata meccanicamente su ghiaccio fino alla fase di centrifugazione in gradiente di saccarosio (Fase 5). In alternativa, la frazione dissociata meccanicamente può procedere alla Fase 5 durante il periodo di incubazione per dissociazione enzimatica (Fase 4.4).
4. Dissociazione enzimatica
- Se nella provetta sono presenti più di 5 mL di tessuto contenente i frammenti di tessuto più grandi rimanenti, dividere il tessuto in altre nuove provette coniche da 50 mL in modo che nessuna provetta abbia più di 5 mL di tessuto.
- Centrifugare la/e provetta/e conica/e conica/e contenente i frammenti di tessuto rimanenti per 5 minuti (350 x g, 4 °C).
- Rimuovere il surnatante e aggiungere la soluzione di digestione enzimatica preriscaldata, in modo tale che ci siano 5 ml di soluzione di digestione per ogni 1 ml di tessuto (ad esempio, 25 ml di soluzione di digestione per 5 ml di tessuto).
- Sigillare i coperchi delle provette coniche con pellicola da laboratorio e incubare la reazione su un rotatore a 37 °C per 30 minuti.
- Dopo l'incubazione, triturare delicatamente i campioni (vedere Figura 2C).
- Utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL, pipettare il campione su e giù 6-8 volte. Evitare di generare bolle d'aria eccessive.
- Aggiungere un puntale per pipetta da 1.000 μl all'estremità della pipetta e triturare altre 6-8 volte.
- Lasciare che i pezzi rimanenti si depositino sul fondo del tubo. Rimuovere e filtrare il surnatante con le cellule ancora sospese attraverso un filtro da 100 μm in una nuova provetta conica da 50 mL etichettata come "Dissociazione enzimatica" e conservare in ghiaccio.
- Se rimangono frammenti di tessuto significativi, aggiungere altri 10 mL di HBSS con calcio e magnesio ai frammenti e ripetere i passaggi 3.5.1 e 3.5.2. Filtrare questa soluzione finale attraverso un filtro da 100 μm nel tubo di "Dissociazione enzimatica".
- Centrifugare la provetta di "Dissociazione enzimatica" per 5 minuti (350 x g, 4 °C) e continuare con la centrifugazione in gradiente di saccarosio.
5. Centrifugazione in gradiente di saccarosio
- Se i campioni sono ancora sospesi in soluzione, centrifugare per 5 minuti (350 x g, 4 °C).
- Rimuovere il surnatante e risospendere il tessuto in 20 mL di HBSS freddo senza calcio e magnesio. Porta il volume fino a 25 ml totali con HBSS freddo.
- Aggiungere lentamente 25 ml di soluzione di saccarosio 1,8 M e capovolgere la provetta per mescolare. Ciò si traduce in un gradiente di saccarosio di 0,9 M.
- Centrifugare senza freno per 10 min (800 x g, 4 °C). L'uso di un freno di centrifugazione interromperà il gradiente e ridurrà la resa (vedere la Figura 2D per un esempio di un campione prima e dopo la centrifugazione).
- Aspirare con cura i detriti di mielina e quanta più soluzione di saccarosio possibile. Lavare il campione aggiungendo 30 ml di HBSS freddo senza calcio e magnesio e mescolando delicatamente. Centrifugare per 5 min (350 x g, 4 °C).
6. ACK Lisi dei globuli rossi
- Rimuovere il surnatante di lavaggio. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi ACK e risospendere delicatamente il pellet cellulare, facendo roteare la provetta per 1 minuto a RT.
- Estinguere la lisi aggiungendo 30 ml di HBSS freddo senza calcio e magnesio.
- Centrifugare per 5 min (350 x g, 4 °C).
7. Manutenzione iniziale della cultura
- Risospendere i pellet cellulari finali in 10 - 15 mL di TSM caldo, completo di fattori di crescita e quantificare la densità cellulare vitale su un emocitometro utilizzando l'esclusione del blu di tripano.
nota: La gamma di cellule vitali varia notevolmente a seconda delle circostanze della donazione di tessuto e la quantificazione può essere difficile in questa fase iniziale a causa dei detriti cellulari residui. In un caso ideale, cerca di avere un milione di cellule vive per campione. Nei casi in cui rimangono detriti in eccesso, lastra a una densità inferiore in un pallone T175.
- Trasferire le sospensioni cellulari finali in un nuovo pallone di coltura T75. Aumentare il picco di fattori di crescita aggiuntivi a giorni alterni per mantenere i livelli complessivi di fattore di crescita e monitorare lo sviluppo delle neurosfere delle cellule tumorali (vedere Figura 2E e Figura 3).
