Differenziazione delle cellule progenitrici neurali del midollo spinale in motoneuroni

Abstract

Fonte: Taga, A. et al., Istituzione di una piattaforma elettrofisiologica per la modellazione della SLA con astrociti e neuroni derivati da cellule staminali pluripotenti umane specifiche a livello regionale. J. Vis. Exp. (2021).

Questo video mostra un metodo per differenziare le cellule progenitrici neurali del midollo spinale (NPC) in motoneuroni. Descrive in dettaglio il processo di coltura delle NPC su una piastra di coltura rivestita utilizzando terreni specializzati arricchiti con inibitori specifici volti a facilitare la differenziazione delle NPC in motoneuroni maturi.

Protocollo

1. Scongelamento delle colture di cellule progenitrici neurali (NPC)

1. Rivestire piastre da 10 cm con poliornitina (PLO) e laminina il giorno prima dello scongelamento delle cellule.
   1. Aggiungere 5 mL di PLO diluito a 100 μg/mL in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o acqua distillata (dH₂O) nelle piastre. Incubare a 37 °C per un minimo di 1 ora fino a tutta la notte.
   2. Aspirare la soluzione di PLO e sciacquare le piastre tre volte con PBS. (L'OLP è tossico se non adeguatamente lavato.)
   3. Aggiungere la laminina diluita in PBS a una concentrazione di 10 μg/mL alle piastre rivestite in PLO. Incubare a 37 °C per almeno 1 ora, preferibilmente tutta la notte. Dopo l'incubazione, aspirare la soluzione di laminina senza risciacquare per migliorare l'adesione cellulare.
      nota: Le piastre possono essere rivestite con PLO in anticipo, lavate tre volte con acqua, asciugate in una cappa sterile e conservate a 4 °C.
2. Scongelare una fiala NPC contenente 6 x 10⁶ cellule/fiala per ogni piastra di coltura cellulare da 10 cm.
3. Rimuovere la crioprovetta NPC dall'azoto liquido e metterla immediatamente a bagnomaria a 37 °C per un massimo di 2 minuti. Scongelare rapidamente agitando la fiala fino a ottenere un piccolo pezzo di ghiaccio circondato da liquido.
4. Trasferire gli aggregati cellulari in una provetta conica da 15 mL utilizzando una pipetta da 1000 μL e aggiungere fino a 15 mL di terreno di differenziazione neurale (NDM) preriscaldato o l'integratore Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) / Ham's F21 F12 per diluire il dimetilsolfossido (DMSO).
5. Centrifugare a 300 x g per 5 min.
6. Aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare con il mezzo di differenziazione del motoneurone (MN) (Tabella 1) + ROCK-I (20 μM) e utilizzare una pipetta da 1000 μl per triturare su e giù fino a ottenere una sospensione a singola cellula (fino a 5 volte).
7. Trasferire la sospensione unicellulare su una piastra di 10 cm rivestita di PLO-Laminin.
8. Trasferire la piastra in un incubatore e lasciarla indisturbata per una notte per consentire una corretta adesione cellulare

2. Differenziare gli NPC del midollo spinale in motoneuroni

1. Eseguire i passaggi iniziali come indicato nei passaggi 1.1-1.8, con il mezzo finale che è il mezzo di differenziazione MN + ROCK-I (20 μM).
2. Il giorno dopo la placcatura, eseguire una sostituzione completa del fluido con il mezzo di differenziazione MN senza ROCK-I, quindi cambiare il fluido a giorni alterni. Durante il fine settimana, alimentare le cellule il venerdì e poi di nuovo il lunedì. Sciacquare le celle con PBS quando necessario per rimuovere i detriti cellulari.
3. Cambiare il terreno con il terreno di differenziazione MN + citosina arabinoside (ARA-C) (0,02 μM) e incubare per 48 ore quando i progenitori gliali impegnati emergono come cellule piatte proliferanti singole sotto progenitori MN post-mitotici aggregati in cluster cellulari.
   nota: Di solito, ciò si verifica entro i primi 7 giorni dopo la piastratura iniziale, anche se può esserci variabilità a seconda della linea cellulare.
4. Dopo 48 ore, aspirare il terreno contenente ARA-C, sciacquare delicatamente le colture con PBS tre volte e cambiare il terreno con un terreno MN fresco senza ARA-C.
5. Dopo il trattamento con ARA-C, eseguire scambi di terreno a giorni alterni (o lunedì, mercoledì e venerdì) rimuovendo il vecchio terreno con una pipetta manuale anziché con un aspiratore a vuoto per prevenire il distacco prematuro dei cluster neuronali. Inoltre, arricchire il terreno MN con laminina 1 μg/mL una volta alla settimana per migliorare ulteriormente l'attaccamento neuronale alle piastre di coltura.

Tabella 1: Cultura Media

Nome medio	Reagenti	Concentrazioni
Mezzo di differenziazione neurale (NDM)	Neurobasale L-Glutammina Aminoacidi non essenziali Supplemento N - Supplemento N2 Penicillina/streptomicina	1x 100x 100x 100x 100x
Mezzo di differenziazione dei motoneuroni	Mezzo di differenziazione neurale Acido ascorbico Puromorphamine Fattore neurotrofico derivato dal cervello Fattore neurotrofico ciliare Fattore di crescita insulino-simile 1 Fattore neurotrofico derivato da linea cellulare gliale Acido retinoico Composto E Supplemento B - Supplemento B27	1x 0,4 μg/mL 1 μM 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1 μM 125 nM 50 volte

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Piastre di coltura sterili da 10 cm	Falcone	353003
Aminoacidi non essenziali (NEAA)	Thermofisher	11140050	Concentrazione di lavoro 100x
Supplemento N - Supplemento N2	Thermofisher	17502048	Concentrazione di lavoro 100x
L-Glutammina	Thermofisher	Codice 25030	Concentrazione di lavoro 100x
Neurobasale	Thermofisher	21103049	Concentrazione di lavoro 1x
Acido retinoico (RA)	sigma	Codice: R2625	Sciogliere 100 mg in 3,3 mL di DMSO per ottenere 100 mM di soluzione madre. Aliquotare il brodo 100 μL/provetta e congelare a -80 ºC. Prelevare 200 μL di materiale da 100 mM e diluire 10 volte (aggiungere 1,8 mL di DMSO) per ottenere 10 mM di materiale da riproduzione. Aliquotare 50 μL/provetta e conservare a -80 ºC. Diluire a 1:10000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 2 μM).
Poliornitina (OLP)	Sigma-Aldrich	P3655	Sciogliere 100 mg in 1 mL di ddW per ottenere 100 mg/mL di soluzione madre. Aliquotare il brodo in provette da 100 μL. (concentrazione di lavoro 100 μg/mL)
Laminina	Thermofisher	Codice 23017-015	Soluzione madre 1 mg/mL, concentrazione di lavoro 10 μg/mL (rivestimento), 1 μg/mL (terreno cellulare)
Acido ascorbico (ASAC)	sigma	Codice: A4403	Sciogliere 100 mg in 250 ml di dH2O per ottenere 0,4 mg/ml di brodo. Filtrare in modo sterile con un filtro da 0,22 μm, aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 0,4 μg/mL).
Fattore neurotrofico ciliare (CNTF)	Peprotech	450-13	Sciogliere 100 μg in 1 ml di PBS sterile, quindi aggiungere 9 ml di BSA-PBS sterile allo 0,1% a 10 μg/mL. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 ng/mL).
Composto E	Abcam	ab142164	Sciogliere 250 μg in 2,0387 mL di DMSO per ottenere un impasto di 250 μM. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire 1:2000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 125 nM).
DMEM/F12	Thermofisher	Codice 113300	Concentrazione di lavoro 1x
Neurotrofico derivato da linea cellulare gliale (GDNF)	Peprotech	450-10	Sciogliere 100 μg in 1 mL di PBS a 100 μg/mL, quindi aggiungere 9 mL di BSA-PBS sterile allo 0,1% a 10 μg/mL. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 ng/mL).
Inibitore ROCK-I	Peprotech	1293823	Sciogliere 5 mg in 1480 μL di dH2O per ottenere 10 mM di stock, aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1: 500 per l'uso. (concentrazione di lavoro 20 μM).
Matita/Streptomicina	Thermofisher	15140122	Concentrazione di lavoro 100x
Purmorfemina (PMN)	Millipore-Sigma	540223	Sciogliere 5 mg in 9,6 mL di DMSO per ottenere 1 mM di soluzione. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 1 μM).
Fattore neurotrofico ricombinante derivato dal cervello umano (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifugare brevemente prima della ricostituzione. Sciogliere 100 μg in 1 mL di PBS a 100 μg/mL, quindi aggiungere 9 mL di BSA-PBS sterile allo 0,1% a 10 μg/mL. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 ng/mL).
Fattore di crescita insulino-simile 1 (IGF-1)	Sistemi di ricerca e sviluppo	291-G1-200	Sciogliere 200 μg in 2 mL di PBS a 100 μg/mL, quindi aggiungere 18 mL di BSA-PBS allo 0,1% per ottenere un impasto di 10 μg/mL e conservare a -80 ºC. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire 10 μg/mL di stock a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 ng/mL).
Neurotrofico derivato da linea cellulare gliale (GDNF)	Peprotech	450-10	Sciogliere 100 μg in 1 mL di PBS a 100 μg/mL, quindi aggiungere 9 mL di BSA-PBS sterile allo 0,1% a 10 μg/mL. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire a 1:1000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 10 ng/mL).
Acido retinoico (RA)	sigma	Codice: R2625	Sciogliere 100 mg in 3,3 mL di DMSO per ottenere 100 mM di soluzione madre. Aliquotare il brodo 100 μL/provetta e congelare a -80 ºC. Prelevare 200 μL di materiale da 100 mM e diluire 10 volte (aggiungere 1,8 mL di DMSO) per ottenere 10 mM di materiale da riproduzione. Aliquotare 50 μL/provetta e conservare a -80 ºC. Diluire a 1:10000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 2 μM).
Composto E	Abcam	ab142164	Sciogliere 250 μg in 2,0387 mL di DMSO per ottenere un impasto di 250 μM. Aliquotare e congelare a -80 ºC. Diluire 1:2000 per l'uso. (concentrazione di lavoro 125 nM).
Supplemento B - Supplemento B27	Thermofisher	21985023	Concentrazione di lavoro 50x
Cappe per colture cellulari sterili	Azienda Baker	Sg-600
Centrifuga per colture cellulari da tavolo	ThermoFisher	75004261	Sorvall Leggenda X1R
Bagno d'acqua	ThermoFisher	Codice 2332	Isotemp
Incubatore per colture cellulari a umidità controllata	ThermoFisher	370	impostato a 37 ºC, 5 % CO2