Isolamento e coltura di progenitori di neuroni granulari cerebellari murini

Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.

1. Preparativi

1. Preparazioni per l'isolamento del CGNP (progenitore del neurone granulare cerebellare)
   1. Organizzare un accoppiamento appropriato di topi per generare animali P5-P7 per isolare il cervelletto (3-5 animali per ChIP e condizione).
   2. Preparare HBSS/glucosio aggiungendo 6 mg/mL di glucosio al tampone HBSS.
   3. Preparare il terreno di coltura cellulare CGNP (CGM) aggiungendo l'1% (v/v) di integratore di N2, l'1% (v/v) di penicillina-streptomicina-neomicina, 25 mM di KCl e il 10% di FCS a DMEM-F12. Per la coltivazione CGNP, preparare il terreno CGM senza FCS ma includendo 0,6 μg/mL di riccio sonico (SHH) (CGM-SHH) e bilanciarlo a 37 °C quando necessario.
   4. Rivestire le piastre per colture cellulari a 6 pozzetti con 100 μg/mL di poli-D-lisina per 1-2 ore a RT per la rimozione delle cellule gliali. Successivamente lavare due volte con ddH₂O sterile e lasciare asciugare le piastre. Conservare le piastre per un massimo di una settimana a 4 °C.
   5. Per la coltivazione di CGNP, rivestire piastre di coltura cellulare a 6 pozzetti con poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 °C per una notte. Successivamente, lavare due volte con H₂O per coltura cellulare e lasciare asciugare le piastre.
      nota: Le piastre possono essere conservate per un massimo di una settimana a 4 °C.
   6. Preparare lo 0,025% di tripsina (p/v) in HBSS/glucosio e bilanciarlo a 37 °C quando necessario.
2. Isolamento dei progenitori neurali del tessuto cerebrale
   1. Isolamento e coltivazione facoltativa di CGNP (progenitori dei neuroni granulari cerebellari)
      1. Eutanasia degli animali P5-7 mediante decapitazione con le forbici. Rimuovere la pelle del cuoio capelluto, aprire il cranio e rimuovere il cervello usando piccole forbici e pinze. Isolare il cervelletto e trasferirlo in HBSS/glucosio ghiacciato. Rimuovere tutte le meningi e i vasi sanguigni e trasferire il cervelletto in provette da 15 ml riempite con HBSS/glucosio freddo.
      2. Lavare la cerella tre volte con 10 ml di HBSS/glucosio ghiacciato (raccoglierli mediante centrifugazione a 650 x g per 5 minuti a 4 °C) e omogeneizzare successivamente la cervelella pipettando delicatamente su e giù con una pipetta da 1 ml (massimo 2-3 volte) per ottenere 0,5-1 mm³ frammenti.
      3. Aggiungere 5 mL di tripsina allo 0,025% in HBSS/Glucosio e incubare il tessuto agitando costantemente in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti. Arrestare la digestione aggiungendo 5 mL di CGM e raccogliere il tessuto mediante centrifugazione a 650 x g per 5 minuti a 4 °C.
      4. Rimuovere il surnatante e triturare il tessuto con una punta di pipetta da 1 mL in CGM da 1 mL e trasferirlo in una nuova provetta da 15 mL.
         nota: È importante evitare bolle d'aria.
         1. Aggiungere 5 ml di CGM e incubare la miscela per 2 minuti su ghiaccio per depositare i residui di tessuto. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 15 mL. Aggiungere 2 ml di CGM al tessuto residuo e ripetere la procedura di triturazione.
      5. Raggruppare i surnatanti (senza residui di tessuto, circa 10 mL in totale) e centrifugare a 650 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere le cellule cerebellari. Risospendere il pellet in 10 mL di CGM.
      6. Poiché gli astrociti aderiscono più velocemente e più forte alla poli-D-lisina rispetto ai CGNP, placcare le cellule su piastre da 100 μg/mL di poli-D-lisina rivestite a 6 pozzetti (fino a 4 mL per pozzetto) e incubare per 20 minuti a 37 °C per rimuovere gli astrociti.
      7. Agitare la piastra e raccogliere il surnatante. Quindi centrifugare a 650 x g per 5 minuti a 4 °C in una provetta da 15 mL. Risospendere il pellet in 10 mL di CGM e contare le cellule con una camera di conteggio Neubauer.
         nota: I CGNP sono rotondi, piccoli e mostrano un alone quando vengono ripresi con la microscopia a contrasto di fase.
      8. Se necessario, seminare le cellule in CGM preriscaldato a 37 °C su piastre rivestite di poli-L-ornitina (3 x 10⁶ cellule per 6 pozzetti) e incubarle a 37 °C, 5% CO₂ e 100% di umidità relativa.
         nota: Lasciare il CGM sulle piastre (e con esso l'FBS) comporterà la differenziazione dei CGNP in neuroni granulari cerebellari (CGN).