Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparativi
- Preparazioni per l'isolamento del CGNP (progenitore del neurone granulare cerebellare)
- Organizzare un accoppiamento appropriato di topi per generare animali P5-P7 per isolare il cervelletto (3-5 animali per ChIP e condizione).
- Preparare HBSS/glucosio aggiungendo 6 mg/mL di glucosio al tampone HBSS.
- Preparare il terreno di coltura cellulare CGNP (CGM) aggiungendo l'1% (v/v) di integratore di N2, l'1% (v/v) di penicillina-streptomicina-neomicina, 25 mM di KCl e il 10% di FCS a DMEM-F12. Per la coltivazione CGNP, preparare il terreno CGM senza FCS ma includendo 0,6 μg/mL di riccio sonico (SHH) (CGM-SHH) e bilanciarlo a 37 °C quando necessario.
- Rivestire le piastre per colture cellulari a 6 pozzetti con 100 μg/mL di poli-D-lisina per 1-2 ore a RT per la rimozione delle cellule gliali. Successivamente lavare due volte con ddH2O sterile e lasciare asciugare le piastre. Conservare le piastre per un massimo di una settimana a 4 °C.
- Per la coltivazione di CGNP, rivestire piastre di coltura cellulare a 6 pozzetti con poli-L-ornitina (0,1 mg/mL) a 4 °C per una notte. Successivamente, lavare due volte con H2O per coltura cellulare e lasciare asciugare le piastre.
nota: Le piastre possono essere conservate per un massimo di una settimana a 4 °C.
- Preparare lo 0,025% di tripsina (p/v) in HBSS/glucosio e bilanciarlo a 37 °C quando necessario.
- Isolamento dei progenitori neurali del tessuto cerebrale
- Isolamento e coltivazione facoltativa di CGNP (progenitori dei neuroni granulari cerebellari)
- Eutanasia degli animali P5-7 mediante decapitazione con le forbici. Rimuovere la pelle del cuoio capelluto, aprire il cranio e rimuovere il cervello usando piccole forbici e pinze. Isolare il cervelletto e trasferirlo in HBSS/glucosio ghiacciato. Rimuovere tutte le meningi e i vasi sanguigni e trasferire il cervelletto in provette da 15 ml riempite con HBSS/glucosio freddo.
- Lavare la cerella tre volte con 10 ml di HBSS/glucosio ghiacciato (raccoglierli mediante centrifugazione a 650 x g per 5 minuti a 4 °C) e omogeneizzare successivamente la cervelella pipettando delicatamente su e giù con una pipetta da 1 ml (massimo 2-3 volte) per ottenere 0,5-1 mm3 frammenti.
- Aggiungere 5 mL di tripsina allo 0,025% in HBSS/Glucosio e incubare il tessuto agitando costantemente in un bagno d'acqua a 37 °C per 15 minuti. Arrestare la digestione aggiungendo 5 mL di CGM e raccogliere il tessuto mediante centrifugazione a 650 x g per 5 minuti a 4 °C.
- Rimuovere il surnatante e triturare il tessuto con una punta di pipetta da 1 mL in CGM da 1 mL e trasferirlo in una nuova provetta da 15 mL.
nota: È importante evitare bolle d'aria.
- Aggiungere 5 ml di CGM e incubare la miscela per 2 minuti su ghiaccio per depositare i residui di tessuto. Trasferire il surnatante in una nuova provetta da 15 mL. Aggiungere 2 ml di CGM al tessuto residuo e ripetere la procedura di triturazione.
- Raggruppare i surnatanti (senza residui di tessuto, circa 10 mL in totale) e centrifugare a 650 x g per 5 minuti a 4 °C per raccogliere le cellule cerebellari. Risospendere il pellet in 10 mL di CGM.
- Poiché gli astrociti aderiscono più velocemente e più forte alla poli-D-lisina rispetto ai CGNP, placcare le cellule su piastre da 100 μg/mL di poli-D-lisina rivestite a 6 pozzetti (fino a 4 mL per pozzetto) e incubare per 20 minuti a 37 °C per rimuovere gli astrociti.
- Agitare la piastra e raccogliere il surnatante. Quindi centrifugare a 650 x g per 5 minuti a 4 °C in una provetta da 15 mL. Risospendere il pellet in 10 mL di CGM e contare le cellule con una camera di conteggio Neubauer.
nota: I CGNP sono rotondi, piccoli e mostrano un alone quando vengono ripresi con la microscopia a contrasto di fase.
- Se necessario, seminare le cellule in CGM preriscaldato a 37 °C su piastre rivestite di poli-L-ornitina (3 x 106 cellule per 6 pozzetti) e incubarle a 37 °C, 5% CO2 e 100% di umidità relativa.
nota: Lasciare il CGM sulle piastre (e con esso l'FBS) comporterà la differenziazione dei CGNP in neuroni granulari cerebellari (CGN).
