Generazione di sferoidi da cellule staminali pluripotenti umane

Abstract

Fonte: Shaker, M. R., et al. Generazione robusta e altamente riproducibile di organoidi cerebrali corticali per la modellazione della senescenza neuronale cerebrale in vitro. J. Vis. Exp. (2022).

Questo video dimostra la trasformazione di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in organoidi cerebrali sferici. Utilizzando inibitori specifici, le hPSC sono guidate a differenziarsi verso una linea neuronale, formando colonie neuroectodermiche. Vengono quindi introdotti speciali fattori di crescita, che incoraggiano l'auto-organizzazione e la proliferazione delle colonie, portando infine alla formazione di organoidi cerebrali sferici.

Protocollo

1. Generazione di organoidi cerebrali corticali (Figura 1)

NOTA: Tutti i passaggi in questa sezione del protocollo si verificheranno in una cappa di biosicurezza di Classe 2, se non diversamente specificato.

1. Induzione di colonie neuroectodermiche 2D da colture 2D di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) (giorni da -1 a 3)
   1. Prima dell'induzione, piastrate le colonie di hPSC su una matrice di membrana basale qualificata per cellule staminali embrionali umane (hESC) in una piastra a 6 pozzetti con una densità del 20%-30%. Per ottenere questa densità, far passare l....

Risultati

Figura 1: Diagramma schematico per la generazione di organoidi cerebrali corticali riproducibili. Flusso di lavoro schematico della procedura sperimentale per la generazione di organoidi cerebrali corticali da hPSC mantenute nel terreno privo di feeder. Il flusso di lavoro fornisce una panoramica di sei passaggi coinvolti nella differenziazione delle hPSC 2D in tessuti umani su piastra corticale mode.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
16% Formaldeide (P/V) Senza metanolo	Thermo Fisher Scientifico	Codice 28908	Il 4% del PFA viene diluito in 1x PBS
2-Mercaptoetanolo 50 mL(1000x)	Tecnologie per la vita in Australia (TFS)	21985023	Utilizzato in supporti NM e DM
B 27 Integratore 10 ml	Tecnologie per la vita in Australia (TFS)	17504044	Utilizzato in supporti NM e DM
Microscopio CKX53 con fotocamera SC50	Olimpo
Piastre per colture cellulari Corning Costar a 6 pozzetti	Sigma Aldrich Pty Ltd	CLS3516-50EA
Dispase II polvere	Thermo Fisher Scientifico	17105041	La polvere viene disciolta in HBSS, filtrata attraverso un filtro da 0,22 μm, aliquote a 10 mL e conservata a -20 °C
DMEM Miscela di nutrienti F12 10x 500 mL (DMEM/F-12)	Thermofisher	11320082	Utilizzato in supporti NM e DM
DMSO dimetil solfossido	Sigma Aldrich Pty Ltd	D2650-100ML
Soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco	Sigma Aldrich Pty Ltd	D1408-500ML
Matrice Falcon Matrigel qualificata hESC	Tecnologie in vitro Pty Ltd	FAL354277	Produrre aliquote da 100 μl e conservarle a -20 °C
GlutaMAX Integratore 100x	Thermo Fisher Scientifico	35050061	Utilizzato in supporti NM e DM
Hanks Soluzione salina bilanciata	Sigma Aldrich Pty Ltd	H8264
Cellule staminali pluripotenti indotte umane (EU79)			Reporogrammato internamente da fibroblasti cutanei
Cellule staminali pluripotenti indotte umane (G22)	Genea Biocells		Ottenuto da Genea Biocells (San Diego, Stati Uniti)
Cellule staminali pluripotenti indotte umane (WTC)			Dono del professor Bruce Conklin
Insoluzione TGF-Β RI Inibitore della chinasi VI, SB431542	Merck	US1616464-5 MG
Soluzione di insulina ricombinante umana	Sigma Aldrich Pty Ltd	I9278	Utilizzato in supporti NM e DM
LDN193189 Dicloridrato	Sigma Aldrich Pty Ltd	SML0559-5MG	Utilizzato durante la differenziazione
di aminoacidi non essenziali MEM (100x)	Thermo Fisher Scientifico	11140050	Utilizzato in supporti NM e DM
mTeSR Plus	TECNOLOGIE STAMINALI	Codice 100-0276	Utilizzato per mantenere le colonie di hiPSC prima della differenziazione con terreni NM
Integratore N2 5 ml (100x)	Tecnologie per la vita Australia Pty Ltd	17502048	Utilizzato in supporti NM e DM
Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL)	Thermo Fisher Scientifico	15140122	Utilizzato in supporti NM e DM
FGF umano ricombinante di base	Sistemi di ricerca e sviluppo	233-FB-01M	Le aliquote sono prodotte a 20 μg/mL e conservate a -20 °C
SB431542	Tocris	Anno 1614	Utilizzato durante la differenziazione
Piastre multipozzetto con attacco ultrabasso, piastra a 24 pozzetti, polistirene	Sigma Aldrich Pty Ltd	CLS3473-24EA

Soluzione