1. Generazione di organoidi cerebrali corticali (Figura 1)
NOTA: Tutti i passaggi in questa sezione del protocollo si verificheranno in una cappa di biosicurezza di Classe 2, se non diversamente specificato.
- Induzione di colonie neuroectodermiche 2D da colture 2D di cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) (giorni da -1 a 3)
- Prima dell'induzione, piastrate le colonie di hPSC su una matrice di membrana basale qualificata per cellule staminali embrionali umane (hESC) in una piastra a 6 pozzetti con una densità del 20%-30%. Per ottenere questa densità, far passare le colonie di hPSC da un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti alla confluenza del 60% in tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti.
- Per il rivestimento della matrice della membrana basale, diluire la matrice della membrana basale con un rapporto di 1:50 in un mezzo basale semplice. Depositare uniformemente 1 mL/pozzetto di una piastra a 6 pozzetti, incubare per 1 ora a temperatura ambiente (RT) e quindi aspirare.
- Mantenere le colonie di hPSC per 1 giorno in 2 mL di un terreno di coltura cellulare privo di siero prima della differenziazione.
- Il giorno della differenziazione delle hPSC, ispezionare le colonie di hPSC utilizzando la microscopia a campo chiaro con un ingrandimento da 4x a 10x per garantire colonie sane senza differenziazione rilevabile.
nota: Le hPSC sane formeranno colonie a bordo stretto con cellule che hanno un nucleo grande, un citoplasma molto piccolo e nucleoli prominenti. Le colonie differenziate di iPSC mostreranno chiare differenze morfologiche rispetto a quelle delle colonie di hPSC descritte sopra, in particolare intorno ai bordi esterni delle colonie o al centro.
- Aggiungere i reagenti elencati nella Tabella 1 per ottenere il terreno N2 necessario per la differenziazione. Portare questo mezzo su RT prima dell'uso.
- Una volta alla RT, aspirare il terreno di coltura cellulare privo di siero da ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e sostituirlo con 2 mL di terreno N2 aggiunto delicatamente con una pipetta sierologica da 5 mL.
- Aggiungere il doppio soppressore delle madri contro gli inibitori decapentaplegici (SMAD), SB-431542 (10 μM) e LDN 193189 (100 nM).
nota: Gli inibitori di SMAD possono essere aggiunti al terreno N2 dopo che il terreno è stato inserito in ciascun pozzetto o alla quantità richiesta di terreno N2 prima di sostituire il terreno di coltura cellulare privo di siero. Gli inibitori possono essere incorporati uniformemente nel terreno facendo roteare delicatamente la piastra o capovolgendo il tubo contenente il mezzo e gli inibitori 3-4 volte.
- Aggiungere quotidianamente terreni N2 freschi integrati con SB-431542 (10 μM) e LDN 193189 (100 nM) a ciascun pozzetto per i successivi 2 giorni.
nota: Il terreno N2 fresco viene aggiunto per ridurre l'esposizione prolungata delle cellule al dimetilsolfossido (DMSO) che viene utilizzato per sciogliere i composti SB-431542 e LDN 193189 e prevenire la citotossicità.
- Generazione di sferoidi neuroectodermici 3D da colonie neuroectodermiche 2D indotte (giorni da 3 a 7)
- Sollevare le colonie neuroectodermiche indotte utilizzando la dispasi seguendo i passaggi 1.2.2-1.2.8.
- Innanzitutto, rimuovere 2 ml di terreno N2 dalla piastra a 6 pozzetti e lavare 1 volta con HBSS per assicurarsi che tutto il terreno N2 sia stato rimosso.
nota: Il terreno N2 può interferire con l'attività enzimatica della dispasi, impedendo un adeguato distacco delle colonie neuroectodermiche dal pozzo.
- Aggiungere 1 mL di 2,4 unità/mL di dispasi in ciascun pozzetto contenente la colonia.
- Incubare il pozzetto per 20-25 minuti (massimo 30 minuti) a 37 °C. Controllare regolarmente il distacco della colonia.
nota: Le piccole colonie possono staccarsi entro 20 minuti. Tutte le colonie che rimangono bloccate dopo 30 minuti dovrebbero essere ignorate.
- Dopo l'incubazione, aggiungere 1 mL di terreno N2 al pozzetto per arrestare l'attività dell'enzima dispasi e trasferire le colonie in una provetta da 15 mL utilizzando un puntale per pipetta P1000 a foro largo o un puntale per pipetta P1000 modificato tagliato con forbici sterili (rendendolo un puntale P1000 a foro largo).
- Lascia che i grumi di colonia affondino sul fondo del tubo con gravità.
nota: Questo processo richiederà circa 1 minuto.
- Una volta che i grumi sono affondati, rimuovere con cautela il surnatante con un puntale per pipetta P1000 standard e sostituirlo con 1 mL di terreno N2 fresco. Ripetere questa fase di lavaggio tre volte per garantire la completa rimozione di dispase.
nota: Qualsiasi dispasi residua impedirà una formazione uniforme di sferoidi neuroectodermici e indurrà la morte cellulare.
- Dopo il lavaggio, risospendere i grumi cellulari in 3 mL di terreno N2, trasferirli in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e aggiungere 40 ng/mL di fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF).
nota: Se un numero elevato di colonie neuroectodermiche si staccasse, queste colonie potrebbero essere piastrate su due o più pozzetti di una piastra a 6 pozzetti per prevenire la fusione degli sferoidi. 24 h dopo il distacco della dispasi delle colonie, controllare se si sono formati gli sferoidi.
- Mantenere gli sferoidi nello stesso terreno per i successivi 3-4 giorni, ma aggiungere bFGF fresco (40 ng/mL) a ciascun pozzetto ogni giorno per promuovere la proliferazione delle cellule neuroectodermiche, l'auto-organizzazione e indurre ed espandere i neuroepiteli><.
nota: Se gli sferoidi sono stati placcati a una densità più elevata, è probabile che il terreno ingiallidi e debba essere sostituito ogni 2 giorni con bFGF fresco (40 ng/mL). Tuttavia, questo non è raccomandato e, invece, dovrebbe essere mantenuto un numero inferiore di sferoidi in ogni pozzetto per evitare questo problema. Gli sferoidi possono essere incorporati nella matrice della membrana basale dopo 3 giorni se i neuroepiteli sono evidenti. Se i neuroepiteli non sono evidenti o non sembrano forti, mantenere gli sferoidi per un altro giorno e controllare di nuovo.
Tabella 1: N2 Medio. La tabella elenca i reagenti necessari per preparare il terreno N2.
Soluzione
| Componenti multimediali | concentrazione |
| DMEM Miscela di nutrienti F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | |
| Integratore N2 5 ml (100x) | Fornito all'1% |
| B 27 Integratore 10 ml | Integrato al 2% |
| di aminoacidi non essenziali MEM (100x) | Integrato all'1% |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/mL) | Integrato all'1% |
| 2-Mercaptoetanolo 50 mL(1000x ) | Integrato allo 0,1% |
