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Tutte le procedure che prevedono la raccolta dei campioni sono state eseguite in conformità con le linee guida IRB dell'istituto.
1. Preparazione di materiale di dissezione, terreni di coltura, dispositivi microfluidici
- Autoclave con pinze e forbici per microdissezione (121 °C, tempo di sterilizzazione: 20 min) e conservatele in un contenitore sterile.
- Sterilizzare i vetrini coprioggetti (24 mm x 24 mm) incubandoli in 1 M HCl per 24 ore su un agitatore orbitale a 37 °C. Lavarli tre volte con H2O sterile distillato e tre volte con etanolo al 99%. Asciugare quindi i vetrini coprioggetti a 37 °C o sotto una cappa di flusso sterile. Infine, sterilizzare in autoclave o esporre i vetrini coprioggetti alla luce UV (30 min) per completare la sterilizzazione. I vetrini coprioggetti possono quindi essere conservati in etanolo al 70%.
- Utilizzando una pinza sterile, rimuovere con cautela i dispositivi di isolamento AXIS Axon dalla confezione e inserirli in una capsula di Petri sterile.
- Utilizzando un punzone per biopsia sterile (ø: 1 mm) creare un foro per campione da coltivare (Figura 1) in corrispondenza delle camere di coltura.
nota: Non perforare troppo vicino alle microscanalature, poiché potrebbero essere danneggiate dalla pressione applicata.
- Sterilizzare i dispositivi di isolamento degli assoni AXIS immergendoli in etanolo al 70%. Quindi asciugare completamente i dispositivi di isolamento AXIS Axon e i vetrini coprioggetti sotto una cappa a flusso sterile. Attendere un minimo di 3 ore prima di procedere.
nota: Un'asciugatura incompleta comporterà un assemblaggio difettoso dei dispositivi microfluidici.
- Posizionare ciascun vetrino coprioggetti in una piastra di Petri da 35 mm o in un pozzetto all'interno di una piastra a 6 pozzetti.
- Posizionare il dispositivo di isolamento AXIS Axon sul vetrino coprioggetti e premere delicatamente ma con fermezza con una pinza con le estremità piegate per consentire la piena adesione tra il dispositivo di isolamento e il vetrino coprioggetti in vetro.
- In ciascuna camera di coltura, pipettare 150 μl di poli-D-lisina (0,1 mg/ml in H2O distillato sterile). Posizionare i dispositivi microfluidici sotto vuoto per 5 minuti, per rimuovere tutta l'aria dalle camere di coltura.
- Se l'aria è ancora visibile all'interno delle camere, ripipettare la soluzione di poli-D-lisina nelle camere.
- Incubare i dispositivi con poli-D-lisina O/N a 37 °C.
- Lavare tre volte le camere con H2O sterile e distillato.
- Riempire le camere con 150 μl di soluzione di lavoro di laminina (Sigma-Aldrich, 5 μg/ml, in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) o terreno privo di siero) e incubare O/N a 37 °C.
- Preparare 50 ml di terreno per colture di gangli trigemini con la seguente composizione: 48 ml di terreno neurobasale, 1 ml di B-27, 100 U/ml di penicillina/streptomicina, 2 mM di L-glutammina, 5 ng/ml di fattore di crescita nervoso (NGF), 0,25 pM di citosina arabinoside.
- Preparare 50 ml di terreno per colture di germi dentali con la seguente composizione: 40 ml di Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)-F12, 10 ml di siero fetale bovino (FBS, concentrazione finale: 20%), 100 U/ml di penicillina/streptomicina, 2 mM di L-glutammina, 150 μg/ml di acido ascorbico.
2. Generazione e dissezione di embrioni di topo
- Determinare l'età embrionale in base al tappo vaginale (tappo vaginale: giorno di sviluppo embrionale 0,5, E0,5) e confermarlo attraverso criteri morfologici. Per questo protocollo, generalmente utilizziamo embrioni di topo E14.5-E17.5.
- Pulire l'area di dissezione e lo stereoscopio con etanolo al 70%.
- Sacrificare la madre incinta attraverso la lussazione cervicale. Posiziona il collo del mouse tra il primo e il secondo dito su una griglia e tira con decisione la coda.
- Sezionare la pelle intorno al basso addome e aprire l'addome usando le forbici. Localizzare l'utero: durante le ultime fasi della gravidanza, l'utero riempie abbondantemente la cavità addominale.
- Sezionare l'utero e metterlo in una provetta riempita di PBS con ghiaccio. Quando è sul ghiaccio, il fazzoletto può essere lasciato per diverse ore. Gettare il cadavere della madre secondo le linee guida istituzionali.
- Sezionare gli embrioni dall'utero e liberarli dai loro tessuti extraembrionali. Metti gli embrioni in PBS sul ghiaccio.
- Decapitare gli embrioni con le forbici e separare la mascella inferiore dal resto della testa con le forbici per microdissezione (Figura 2A). Rimuovere la mascella inferiore con precisione, senza danneggiare i gangli del trigemino; Poiché questi ultimi sono localizzati in prossimità della mascella inferiore, è possibile il loro danno accidentale. Conservare la mascella inferiore e il resto della testa in PBS freddo, su ghiaccio.
- Per sezionare i gangli del trigemino (TG), prendere la testa e posizionarla su una piastra di Petri in vetro da dissezione, precedentemente riempita con PBS freddo. Usando il forcipe, rimuovere la pelle e il cranio. Quindi rimuovere il telencefalo e il cervelletto posizionando una pinza sotto il telencefalo e sollevare; Il telencefalo e il cervelletto si capovolgeranno insieme, lasciando esposta la parte inferiore del cranio.
- Localizzare i gangli del trigemino (Figura 2B). Usa una pinza per separare il TG dai nervi trigemino. Eliminare i resti delle sporgenze del trigemino utilizzando gli aghi di dissezione come coltelli. Metti i TG sezionati in una capsula di Petri piena di PBS freddo e tienili in ghiaccio.
- Per sezionare i denti embrionali, posizionare la mascella inferiore, precedentemente separata dal cranio, sulla capsula di Petri in vetro di dissezione, riempita con PBS freddo. Usando aghi da dissezione come coltelli, rimuovere la lingua e la pelle che circonda la mascella. Separare l'emiganomancia sinistra e quella destra tagliando lungo la linea mediana della mascella. I germi dei denti sono facilmente visibili, come mostrato nella Figura 2C. Isolare i germi dei denti utilizzando aghi da dissezione e rimuovere i tessuti non dentali in eccesso. Mettere i germi dei denti sezionati in una capsula di Petri riempita con PBS freddo e tenerli in ghiaccio.
3. Co-colture microfluidiche
- Dopo la dissezione, rimuovere la laminina dai dispositivi microfluidici. Riempire le camere con 200 μl dei rispettivi mezzi.
- Con una pinza, trasferire delicatamente il TG sezionato e i germi dei denti nei fori creati dalla punzonatura (Figura 2D). Assicurarsi che i germi dei denti non galleggino e che affondino fino a quando non toccano i vetrini.
- Coltura dei campioni in un incubatore a 37 °C, 5% CO2.
- Cambiare il supporto di coltura ogni 48 ore. Non svuotare completamente le camere e non pipettare direttamente nelle camere di coltura.
Lo svuotamento completo delle camere comporterebbe la formazione di bolle d'aria all'interno delle camere; Il pipettaggio diretto nella camera provocherebbe danni assonali. Per evitare questi problemi, rimuovere il terreno puntando la pipetta verso il lato esterno dei pozzetti; Allo stesso modo, pipettare il terreno fresco sul lato dei pozzetti situati di fronte alle camere.
- Le co-colture possono essere facilmente visualizzate con la microscopia time-lapse durante il periodo di coltura e possono essere mantenute per oltre 10 giorni.
- Dopo il periodo di coltura, lavare le camere pipettando 150 μl di PBS in un pozzetto per camera e lasciando che il PBS fluisca attraverso le camere tre volte.
- Rimuovere il PBS e fissare i campioni pipettando 150 μl di paraformaldeide al 4% (in PBS) in un pozzetto per camera; incubare a RT per 15 minuti. Lavare le camere due volte con PBS come descritto al punto 3.6.
- Procedi con ulteriori analisi.
