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NOTA: La Figura 1A, B mostra uno schema del chip di copolimero olefinico ciclico (COC) preassemblato, comprese le posizioni dei canali o compartimenti principali, pozzetti e microscanalature. Il chip compartimentato può stabilire microambienti fluidici distinti all'interno di un compartimento, come dimostrato dall'isolamento del colorante alimentare (Figura 1C).
1. Rivestimento di chip multicompartimentali per neuroni hSC
NOTA: La Figura 2A mostra una panoramica delle procedure di rivestimento.
- Sciogliere la poli-L-ornitina in acqua distillata per colture cellulari per ottenere 600 μL di soluzione per chip di una soluzione di lavoro da 20 μg/mL.
- Aspirare la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) rimanente dopo aver preparato i trucioli dai pozzetti. Durante l'aspirazione, assicurarsi che la punta della pipetta sia lontana dall'apertura del canale.
nota: I canali microfluidici devono rimanere riempiti per l'intera durata di questa procedura. Non aspirare liquidi dai canali/compartimenti, ma solo dai pozzetti.
- Caricare 150 μL di soluzione di lavoro di poli-L-ornitina nel pozzetto in alto a destra. Attendere 90 secondi o fino a quando il liquido inizia a riempire il pozzetto in basso a destra. Aggiungere 150 μl di terreno nel pozzetto in basso a destra e attendere 5 minuti per far passare il liquido attraverso le microscanalature.
- Aggiungere 150 μl di terreno nel pozzetto in alto a sinistra. Attendere 90 s e poi aggiungere 150 μl nel pozzetto in basso a sinistra. Avvolgere il supporto del/i truciolo/i con parafilm e posizionarlo a 4 °C per una notte.
nota: In alternativa, posizionare il chip e il supporto a 37 °C per 1 ora.
- Aspirare il terreno dai pozzetti, assicurandosi che il puntale della pipetta sia posizionato lontano dall'apertura del canale. Aggiungere 150 μL di acqua sterile nel pozzetto in alto a destra. Attendere 90 s e poi aggiungere 150 μl nel pozzetto in basso a destra. Attendere 5 minuti per far passare il liquido attraverso i microsolchi.
- Aggiungere 150 μL di acqua sterile nel pozzetto in alto a sinistra, attendere 90 s, quindi aggiungere altri 150 μL nel pozzetto in basso a sinistra.
- Ripetere i passaggi 1.5-1.6.
- Scongelare lentamente la laminina a una temperatura compresa tra 2 °C e 8 °C e preparare una soluzione di lavoro da 10 μg/mL.
- Caricare 150 μl della soluzione di lavoro della laminina nel pozzetto in alto a destra. Attendere 90 secondi o fino a quando il liquido inizia a riempire il pozzetto in basso a destra. Pipet 150 μL al pozzetto in basso a destra. Attendere 5 minuti per far passare la laminina attraverso i microsolchi.
- Aggiungere 150 μL di laminina nel pozzetto in alto a sinistra. Attendere 90 s e poi aggiungere 150 μl nel pozzetto in basso a sinistra. Incubare il chip all'interno del suo supporto per 2 ore a 37 °C.
- Sciacquare il chip con PBS (senza Ca2+ e Mg2+). Caricare 150 μL di PBS nel pozzetto in alto a destra. Attendere 90 secondi o fino a quando il liquido inizia a riempire il pozzetto in basso a destra. Aggiungere 150 μl di PBS nel pozzetto in basso a destra e attendere 5 minuti per far passare il PBS attraverso i microsolchi.
- Pipettare 150 μL di PBS nel pozzetto in alto a sinistra. Dopo 90 s pipettare 150 μL nel pozzetto in basso a sinistra.
- Aspirare il PBS dal chip, quindi sciacquare il chip con il mezzo NSC (vedere la tabella dei materiali). Caricare 150 μL di terreno nel pozzetto in alto a destra. Dopo 90 s o quando il liquido passa attraverso il canale destro nel pozzetto in basso a destra, aggiungere 150 μl al pozzetto in basso a destra. Attendere 5 minuti per far fluire il fluido attraverso le microscanalature.
- Aggiungere 150 μL di terreno nel pozzetto in alto a sinistra e altri 150 μL nel pozzetto in basso a sinistra. Incubare il chip in un incubatore a 37 °C con il 5% di CO2 per precondizionare il chip fino al momento di seminare le NSC.
nota: Le patatine possono essere pre-condizionate durante la notte, se necessario.
2. Seeding di NSC nel chip multiscomparto
NOTA: Questo protocollo utilizzava NSC acquistate commercialmente, a differenza della nostra precedente pubblicazione che iniziava con cellule staminali embrionali umane. In questo protocollo, le cellule staminali neurali vengono piastrate direttamente nei chip di plastica, dove si differenziano in neuroni. Le cellule possono essere lasciate proliferare come NSC (senza differenziazione) per un massimo di 2 passaggi e conservate in fiale nel liquido N2 per un ulteriore utilizzo. Questo protocollo utilizza fiale NSC conservate nel liquido N2 dopo il passaggio 1 o 2. La Figura 2B mostra una panoramica delle procedure di rivestimento.
- Scongelare gli NSC secondo le istruzioni del produttore.
nota: Questa procedura si applica alle NSC derivate da H9. Altre linee cellulari richiederanno l'ottimizzazione della densità cellulare.
- Contare la concentrazione cellulare utilizzando un emocitometro e regolare utilizzando terreni NSC per ottenere una concentrazione di 7 x 106 cellule per mL.
- Aspirare il fluido da ciascun pozzetto del chip. Evitare di aspirare i fluidi dai canali principali.
- Pipettare 5 μL della soluzione cellulare nel pozzetto in alto a destra, seguito da 5 μL nel pozzetto in basso a destra (70.000 celle in totale). Assicurarsi che le cellule siano pipettate verso le aperture del canale principale. Utilizzare un microscopio per verificare che le cellule siano entrate nel canale. Attendere 5 minuti affinché le celle aderiscano alla parte inferiore del chip.
nota: Uno o entrambi gli scomparti possono essere utilizzati per caricare le celle.
- Pipettare ~150 μL di terreno NSC nel pozzetto in alto a destra e poi 150 μL nel pozzetto in basso a destra. Ripeti sul lato sinistro. Incubare al 5% di CO2, 37 °C in un idoneo contenitore umidificato.
- Dopo 48 ore, aspirare il terreno NSC dai pozzetti e sostituirlo con un terreno di differenziazione neurale aggiungendo 150 μL a ciascun pozzetto superiore e inferiore.
- Coltura di neuroni all'interno di un'incubatrice al 5% di CO2, 37 °C all'interno di un contenitore umidificato adatto.
