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1. Preparazione delle Soluzioni
- Preparare una soluzione di dissociazione tissutale a base di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) sterile contenente rosso fenolo con papaina (100 U/ml), cisteina (0,2 mg/ml) e desossiribonucleasi (DNasi, 250 U/ml).
- Per preparare la soluzione di DNasi, diluire 100 mg della polvere liofilizzata di DNasi I (un flacone) in 50 mL di H2O. Mescolare bene e filtrare la soluzione madre. Preparare 10 mL di aliquote di brodo. Dividere una provetta madre in aliquote monouso da 0,5 mL. Conservare queste aliquote monouso a -80 °C.
- Preparare i reagenti di separazione magnetica preparando il tampone X della colonna magnetica: albumina sierica bovina (BSA) allo 0,5% e soluzione di acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) 2 mM.
- Per preparare i terreni della neurosfera, utilizzare un terreno neurobasale contenente penicillina/streptomicina con L-glutammina e integrare con il 2% di B27, 20 ng/mL di fattore di crescita epidermico ricombinante umano (EGF) e 20 ng/mL di fattore di crescita dei fibroblasti basici ricombinanti umani (bFGF).
- Per preparare i terreni di differenziazione, utilizzare un terreno neurobasale e integrare con 10 ng/mL di fattore di crescita derivato dalle piastrine (PDGF-AA) o 10 ng/mL di fattore inibitorio della leucemia (LIF) e 2% di B27.
- Utilizzare piastre di coltura a 12 pozzetti (3,5 cm2) e 6 pozzetti (9,6 cm2) con attacco ultrabasso.
2. Dissezione del cervelletto
- Anestetizzare i cuccioli di topo (P3-P7) con isoflurano e decapitarli con le forbici chirurgiche.
- Spruzzare le teste separate dei cuccioli con etanolo al 70%.
- Trasferire ogni testa in una capsula di coltura sterile vuota da 10 cm. Separare la pelle usando le forbici per microdissezione, quindi rimuovere il cranio facendo scorrere le forbici sagittali lungo la linea mediana.
- Usando la pinza #7, staccare le ossa del cranio iniziando caudalmente dal tronco encefalico. Sollevare con cautela il cervello usando una spatola, mantenendo intatto il cervelletto, e trasferire il cervello in un piatto fresco sterile da 10,0 cm contenente 15 ml di soluzione di sale bilanciato (HBSS) ghiacciata di Hanks.
- Posizionare il piatto contenente il cervello sotto un microscopio da dissezione. Usando una pinza fine #5, rimuovi le meningi e i grandi vasi sanguigni dal cervelletto e separa il cervelletto dal tronco encefalico usando la spatola.
- Trasferire il cervelletto in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5,0 mL di soluzione HBSS ghiacciata. Lavare il cervelletto risciacquando e decantando 3 volte con 5,0 ml di HBSS.
nota: Ogni cervelletto deve essere posto nella propria provetta per un'ulteriore elaborazione.
3. Preparazione della sospensione cellulare
- Posizionare il piatto contenente il cervello sotto un microscopio da dissezione. Usando una pinza fine #5, rimuovi le meningi e i grandi vasi sanguigni dal cervelletto e separa il cervelletto dal tronco encefalico usando la spatola.
- Trasferire il cervelletto in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 5,0 mL di soluzione HBSS ghiacciata. Lavare il cervelletto risciacquando e decantando 3 volte con 5,0 ml di HBSS.
nota: Ogni cervelletto deve essere posto nella propria provetta per un'ulteriore elaborazione.
- Dopo l'ultimo risciacquo, aggiungere 5 mL di soluzione di dissociazione tissutale a base di papaina che è stata preriscaldata a 37 °C. Incubare il tessuto per 15 minuti a 37 °C a bagnomaria. Mescolare lentamente il contenuto capovolgendo il tubo su e giù 3 volte o 5 volte ogni 3 minuti utilizzando un mixer nutante o a mano.
- Preparare una pipetta Pasteur di diametro largo (normale pipetta di vetro) e una pipetta Pasteur di diametro stretto (lucidata a fuoco riscaldandola su un bruciatore Bunsen) come descritto in precedenza.
- Lavare il fazzoletto 3 volte con 5 mL di soluzione HBSS, evitando la perdita del fazzoletto durante la decantazione a mano.
- Rimuovere l'ultimo lavaggio HBSS e aggiungere al tessuto 5 ml di soluzione DPBS contenente 250 μL di soluzione di DNasi. Dissociare il tessuto triturando 10x-15x utilizzando la pipetta Pasteur di ampio diametro. Eseguire questo passaggio delicatamente per evitare la formazione di bolle.
- Quindi incubare il liquame per altri 10 minuti a 37 °C a bagnomaria, mescolando capovolgendo e raddrizzando il tubo.
- Utilizzare la pipetta Pasteur di diametro ridotto per triturare ulteriormente il liquame di tessuto 10 volte. Se rimangono grandi pezzi di tessuto, premere delicatamente i pezzi di tessuto contro il fondo della provetta con la punta della pipetta e continuare a pipettare fino a quando le cellule non raggiungono una sospensione fine.
- Incubare il fazzoletto a 37 °C per altri 10 minuti, ripetendo le fasi di miscelazione precedenti.
4. Immunomarcatura delle cellule staminali
- Posizionare le provette da centrifuga sul ghiaccio e utilizzare soluzioni ghiacciate per i passaggi successivi. Filtrare le cellule dissociate attraverso un filtro cellulare da 40 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL. Riempire il filtro con 10,0 mL di soluzione HBSS per garantire che le cellule passino attraverso la rete in questa soluzione aggiuntiva.
- Trasferire le cellule filtrate in una provetta da centrifuga fresca da 15 mL e centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 10 minuti a 4 °C. Aspirare ed eliminare completamente il surnatante utilizzando con cautela un aspiratore a vuoto.
- Risospendere il pellet in 160 μL di tampone a colonna magnetica. Per ottenere la sospensione a cella singola prima della marcatura magnetica, far passare le celle attraverso una rete di nylon da 30 μm per rimuovere i grumi di cellule, che altrimenti potrebbero ostruire la colonna.
- Aggiungere 40 μL di microsfere anti-prominina-1 a ciascuna provetta da 15 mL, mescolare e incubare in frigorifero per 15 minuti in modo che l'anticorpo si leghi alle cellule che esprimono la prominina-1.
- Lavare le cellule aggiungendo 1,0-2,0 mL di tampone X per la colonna e centrifugare a 300 x g per 10 minuti. Aspirare completamente il surnatante.
- Risospendere il pellet in 1,0 mL di tampone in colonna X.
nota: Se si notano piccoli grumi dopo la risospensione del pellet con 1,0 mL di tampone X della colonna, devono essere rimossi con cura utilizzando la punta della pipetta Pasteur, altrimenti questi grumi possono ostruire la colonna magnetica durante lo smistamento delle cellule.
5. Preparazione della colonna magnetica, smistamento delle celle e placcatura
NOTA: La separazione magnetica da diverse condizioni genotipiche (malattia vs. controllo) deve essere eseguita contemporaneamente, poiché qualsiasi ritardo può influenzare la morfologia della neurosfera.
- Preparare le colonne magnetiche posizionandole sul supporto magnetico esposto al campo magnetico. Sciacquare una volta la colonna con 500 μL di tampone X applicando il tampone che gocciola in una provetta da centrifuga per essere scartato.
nota: Preparare il tampone X della colonna magnetica fresca per ogni esperimento; In caso contrario, la resa delle cellule staminali sarà bassa.
- Applicare la sospensione cellulare marcata sulla colonna. Raccogliere il flusso contenente cellule non marcate costituite principalmente da cellule miste neuronali/gliali cerebellari in provette fresche da 15 ml (Figura 1A).
- Lavare la colonna 3 volte con 500 μl di tampone X (ogni lavaggio dura circa 2-4 minuti).
nota: La coltura mista neuronale cerebellare/gliale arricchita con neuroni granulari cerebellari può fungere da utile sottoprodotto di questa fase di purificazione.
- Rimuovere la colonna dal campo magnetico e inserirla in una provetta da 1,5 mL. Aggiungere 1,0 mL di terreno di coltura (terreno neurosferico) alla colonna e spingere lo stantuffo nella colonna per eliminare le cellule marcate con perle di prominina-1 in una provetta di falco fresca da 1,5 mL.
- Per migliorare la purezza delle cellule marcate con prominina-1, passare le cellule eluite su una seconda colonna seguendo i passaggi 5.1-5.4.
- Contare le cellule con un emocitometro. La resa tipica è di10-7 cellule per cervelletto. Piastra le celle su piastre di fissaggio ultra-basse (6 o 12 pozzetti, in base alla densità richiesta per gli esperimenti a valle).
6. Passaggio delle neurosfere e differenziazione
- Piastra le cellule staminali marcate con prominina-1 su piastre a 12 pozzetti a bassissimo attacco in terreno neurosferico (5.000 cellule/pozzetto).
- Dopo 7-10 giorni, le cellule si dividono per produrre neurosfere fluttuanti a forma di palla (neurosfere primarie).
nota: In questo esperimento, vengono generate neurosfere secondarie che si espandono di numero per un ulteriore utilizzo. Le popolazioni primarie di neurosfere non vengono utilizzate per questi esperimenti poiché possono contenere cellule contaminanti che non hanno proprietà di cellule staminali e possono aggregarsi con le neurosfere.
- Per il passaggio, trasferire le neurosfere primarie insieme ai terreni di coltura utilizzando puntali per pipette da 1,0 mL in una provetta da centrifuga sterile da 15 mL. Pellettare le neurosfere mediante centrifugazione a 300 x g per 5 minuti e scartare il surnatante.
- Risospendere il pellet in 5 mL di terreno di dissociazione tissutale contenente papaina o soluzione di tripsina allo 0,05%. Incubare a 37 °C per 10 min.
- Centrifugare la sospensione cellulare a 300 x g per 5 minuti. Risospendere le cellule in 5 mL di terreno neurosferico e dissociare le cellule meccanicamente utilizzando una pipetta di plastica Pasteur e pipettando lentamente su e giù 10 volte.
- Placcare le cellule (di nuovo) in mezzi di neurosfera come descritto in precedenza. Dopo 7-10 giorni di coltura, la piastra deve essere arricchita con neurosfere secondarie.
nota: Queste colture possono essere passate fino a 8 volte con buona efficienza, dopodiché le dimensioni della neurosfera tendono ad essere più piccole e suggeriscono una diminuzione della proliferazione.
- Contare le cellule sull'emocitometro e impostare il numero ottimale per futuri esperimenti su piastre rivestite di poli-D-lisina (6 o 12 pozzetti).
- Per differenziare le cellule staminali, raccogliere le neurosfere dal secondo all'ottavo passaggio mediante centrifugazione come descritto in precedenza, tranne aggiungere un mezzo di differenziazione al pellet><.
nota: Dopo 7 giorni in vitro, le cellule staminali si differenziano in neuroni, astrociti e oligodendrociti, come dimostrato dalla colorazione con il marcatore neuronale β-III tubulina, il marcatore astrocitario Glial fibrillary acidic protein (GFAP) e il marcatore oligodendrocitario O4.
